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发散思维：如何让番茄—马铃薯图成真？
第二节
通过体细胞杂交可获得新的植物体
将两个来自不同种植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并将杂种细胞培育成新的植物体的技术。
1．你认为两个来自不同植物的体细胞完成融合，遇到的第一个障碍是什么？
2．有没有一种温和的去壁方法呢？
3．两个原生质体能发生融合与细胞膜的什么特性有关？
4．如何将杂种细胞培育成杂种植株？
请思考：
思考1：
两细胞融合的原理是？
不同植物的体细胞发生融合，遇到的第一个障碍是什么？
如何去掉细胞壁呢？
酶解法
果胶酶
纤维素酶
原生质体
一、成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
1、原生质体的概念：植物细胞除去壁后的部分，
包括 。
细胞膜、细胞质、和细胞核
(呈 )
球形
2、优势：没有细胞壁的阻碍
①更容易被转入外源基因，是植物基因工程的理想受体
②植物细胞之间的融合得以实现
植物细胞工程
3、制备方法
原生质层：液泡膜、细胞膜及两者之间的部分
在0.5~0.6mol/L的甘露醇（或一定浓度的蔗糖）环境下，用纤维素酶和果胶酶混合液处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞
形成高渗环境，使细胞处于微弱的质壁分离状态，这样有利于完整的原生质体的释放，防止原生质体被破坏
对细胞处理和培养过程中所用的材料和试剂要经过什么处理？
用G6玻璃砂漏斗过滤灭菌
消毒/无菌培养材料
原生质体培养程序示意图
①预处理即对烟草植株限制供水
②取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表皮切成4cm的小块
③加入混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5 % ）并加入的0.7mol甘露醇0.1mmolCaCl2. PH5.6
④将小块烟叶放入混合酶液25 ℃处理8~10小时
⑤过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液含0.1 m mol CaCl2 ）。如此2~3次、得原生质体
下图是烟草叶片原生质体分离和培养的流程图。请回答下列问题：
(1)酶解时，在经________处理的纤维素酶和果胶酶的混合液中，还需添加____________来提高混合液的渗透压，以便获得完整的无菌原生质体。
(2)获得原生质体后，可用___________________法检测原生质体是否存活。然后将原生质体制成悬浮液，滴加在________________上，用显微镜观察并计数。要判定原生质体是否已形成细胞壁，可用___________法鉴别。
(3)欲通过原生质体培养得到愈伤组织，从培养基的成分(除琼脂外)考虑，配制培养基时需要注意的主要方面是___________________________。
甘露醇/蔗糖
血细胞计数板
观察是否有胞质环流
质壁分离
植物生长调节剂的适当配比
红墨水染色法、呼吸速率测定
过滤除菌
原 生 质 体 活 力 测 定
A、形态识别
形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。
原 生 质 体 活 力 测 定
B、荧光显微镜识别(FDA法)
本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。
使用浓度：0.01%
原 生 质 体 活 力 测 定
C、酚藏花红染色法（0.1%)
酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。
伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%)
有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。
思考2：
两个原生质体如何融合在一起呢？
体现了细胞膜的流动性
物理法:
化学法:
电刺激法、离心法、振荡法等
聚乙二醇（PEG）
活细胞互相紧密接触前提下，给予短暂的高压脉冲，引起细胞膜的穿透，随后细胞膜发生结合导致细胞融合。
植物细胞A
植物细胞B
去壁
去壁
原生质体A
原生质体B
融合
原生质体AB
酶解法
融合原理及常用方法？
物理方法：离心、振荡、电刺激
化学方法：聚乙二醇（PEG）
得到的一定是目标杂种细胞么？
专一性
原理：生物膜流动性
植物体细胞杂交过程
杂种细胞AB
再生细胞壁
细胞融合成功的标志
原生质体两两融合，培养基中可能会出现哪些细胞类型？
重组类型
培养基中细胞类型
AA AB BB A B
筛选！
植物细胞A
植物细胞B
去壁
去壁
原生质体A
原生质体B
融合
原生质体AB
再生细胞壁
杂种细胞AB
脱分化
愈伤组织
杂种植株
再分化
原生质体融合
植物组织培养
酶解法
利用杂种细胞获得杂种植株所依据的原理？
原理：
生物膜流动性
杂交细胞的筛选
植物体细胞杂交过程
原理：
植物细胞全能性
原因：一个融合体系中细胞并非均为杂种细胞
获得的杂种植株是否一定能表现出人们所期望的性状？可能原因？
杂种植株的鉴定和选育（必要）
1978年梅尔彻斯等用植物体细胞杂交技术培育出的马铃薯-番茄“Pomato”，外形倾向于番茄植株，花和叶具有杂种特点，并结有畸形的小果实，但在根部没有形成块茎。
番茄基因抑制了马铃薯块茎生成基因的表达；
杂种细胞融合/培养过程中可能出现染色体丢失、结构异常等情况
白菜
甘蓝
白菜—甘蓝
二、由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性
美国的科学家曾经选择了两种烟草进行细胞融合．这两种烟草,一种是产量很高的栽培品种,一种是抗病害能力很强的野生种．融合的细胞再经过培养,长成了一株面目一新的烟草．它兼有高产和抗病害的优点,而且能直接繁育后代．一个优良的新品种就此产生！
已获得多种植物种间、属间甚至是科间的杂种细胞、愈伤组织
植物体细胞杂交技术的优点：
打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍
“白菜—甘蓝”是科学家用植物细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长周期短，耐热性强和易储存等优点。下图是“白菜—甘蓝”培育过程示意图，请完成下列有关问题：
(1)由杂种细胞D培育成“白菜—甘蓝”植株，采用的技术手段是_____________。该过程说明植物细胞具有______________。
(2)要制备“白菜—甘蓝”的人工种子，要在e步骤选取具有生根发芽能力的____________(结构)，包裹上人造种皮制得。
(3)在a过程中诱导原生质体融合最常用的诱导剂是_________，融合依据的原理是__________________。
植物组织培养
全能性
胚状体
聚乙二醇
细胞膜的流动性
（二）某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究，请回答：
（1） 原生质体的分离：在无菌条件才，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5mol/L的甘露醇（维持较高渗透压）的___________混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。
原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞，此时，应该___________培养基中甘露醇的浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两次途径形成再生植株。途径一：细胞团形成__________，最后发育成植株。
途径二：细胞团增殖为愈伤组织，然后在发芽培养基上又到出芽，切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是___________
（3） 为了对烟草的某些性状进行改良，分离得到两种烟草的原生质体，通过___________方法将它们的遗传物质组合在一起，经培养获得具有新性状的再生植株，提取再生植株的DNA鉴定遗传物质是否成功重组。
真题 2016年10月
（二）（1）纤维素酶和果胶酶
（2）降低 胚状体 细胞分裂素 D
（3）原生质体融合 PCR
本节小结
项目 植物组织培养 植物体细胞杂交技术
所属范畴
原理
步骤
意义
联系
保持优良性状,繁殖速度快、大规模生产提高经济效益
植物体细胞杂交技术应用了植物组织培养技术
①去除细胞壁
②融合形成杂种细胞
③组织培养
细胞全能性
细胞膜一定的流动性、细胞全能性
染色体畸变、基因重组
无性繁殖
①脱分化
②再分化
克服不同种生物远缘杂交的障碍
为何不直接用配子杂交？
1、获得原生质体的方法是:
__________________________________
3、细胞融合的原理：
_______________________
2、诱导原生质体融合的方法是：
_______________________________________
3、植物体细胞杂交成功的标志是：
________________________
4、植物体细胞杂交需要用的技术包括：
_______________________
5、植物体细胞杂交与有杂交相比其优点是：
_______________________
课堂小结：
酶解法：纤维素酶和果胶酶(在高渗溶液中）
细胞膜具有一定的流动性
化学方法：聚乙二醇 物理方法：振动、电刺激、离心
融合的原生质体形成细胞壁
植物细胞融合和植物组织培养
克服了远源亲本交杂不亲和的障碍
(4)要获得上图中白菜和甘蓝的原生质体，首先需要分别除去白菜和甘蓝细胞的细胞壁。现提供以下材料和用具：紫色洋葱磷片叶、适宜浓度的蔗糖溶液、纤维素酶和果胶酶、蒸馏水、镊子、显微镜、载玻片等。请你从中选择合适的材料，完成下面检验是否已除去细胞壁实验的方法步骤，并预测和解释实验结果。
主要实验步骤：
①选取适宜浓度的蔗糖溶液，加入适量纤维素酶和果胶酶配制成细胞壁分解液。其中选取适宜浓度的蔗糖溶液而不用蒸馏水的理由是：适宜浓度的蔗糖溶液______________________________________________________。
可防止原生质体过度吸水涨破(保持原生质体正常的形态)
植物体细胞杂交后代的遗传变化
亲　本 P1:2n(Aabb)与P2:2m(ccDd)
生殖类型 无性生殖,育种过程中不遵循孟德尔定律
变异类型 染色体数目变异
染色体数 两亲本染色体数之和,即2n+2m
染色体组数 两亲本染色体组数之和,即2+2
基因组成 两亲本基因型之和,即AabbccDd
思考：利用植物体细胞杂交的方法培育作物新品种过程中，遗传物质的传递是否遵循孟德尔的遗传规律？
【答案】孟德尔的遗传规律发生在有性生殖的减数分裂过程中，而植物体细胞杂交过程中细胞增殖的方式是有丝分裂，没有减数分裂，故此过程遗传物质的传递不遵循孟德尔遗传规律
在这个过程中，哪一步实现起来相对可能存在难度？
分化的组织
愈伤组织
脱分化
分化的组织
再分化
图示为“白菜-甘蓝”杂种植株的培育过程，请回答下列问题:
(1)步骤①需要用到的试剂是什么
(2)步骤②所用的方法有哪些
(3)经过步骤③得到的杂种细胞和融合的原生质体的区别是什么
(4)杂种细胞能发育成“白菜-甘蓝”植株的理论基础是什么
纤维素酶、果胶酶
电刺激、离心、振荡、聚乙二醇（PEG）等
杂种细胞具有细胞壁
植物细胞的全能性
课后简答题
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经__________处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有___________________（答出2点即可）。
过滤灭菌
观察胞质环流法、渗透吸水法、红墨水染色法、呼吸速率测定
真题［2020浙江1月］
3．影响原生质体分离的数量和质量的因素：材料的种类和生理状态；酶的种类、酶解时间和温度；酶液的浓度；分离与纯化的方法等。
4．原生质体培养时的培养基渗透压应低于原生质体分离时的渗透压，原生质体培养时，其再生出细胞壁是其能进行有丝分裂的前提。
2．原生质体活性的鉴定方法：观察是否有胞质环流；染色法；
以氧的摄入为指标，表示呼吸强度。

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