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复习提问
1.限制酶的来源？特点？作用部位？
2.DNA连接酶的作用？主要有哪两类？区别？
3.什么是质粒？
4.基因工程中最常使用的载体是 ，还有 。
5.质粒作为载体，需要具备的条件。
①质粒要能与外源DNA片段（目的基因）连接，需具备什么条件？
②要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，质粒应具备什么条件？
③我们用肉眼看不到质粒是否携带着目的基因进入了受体细胞内，为了便于筛选重组DNA分子，质粒需要具备什么条件？
6.DNA粗提取的原理？鉴定的原理？
判断：
1.限制酶的切割位点可以在识别序列的内部或外部。
2.不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。
3.用不同的限制酶切割产生的黏性末端，也可能连接在一起。
判断：
1.限制酶的切割位点可以在识别序列的内部或外部。
2.不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。
3.用不同的限制酶切割产生的黏性末端，也可能连接在一起。
c酶 d酶
3
3
3
3
5
5
5
5
a、b、c、d酶的识别序列及切点如图所示
学习目标
掌握目的基因的筛选与获取方法
（生命观念、科学思维）
01
02
学会基因表达载体构建的方法和要求
（科学探究）
理解目的基因导入受体细胞的具体过程（科学探究）
掌握目的基因检测与鉴定的方法
（科学探究、社会责任）
掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法（科学探究）
03
04
05
3.2 基因工程的基本操作程序
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉与普通棉花
从社会中来
抗虫棉的培育过程
2.基因表达载体的构建
1.目的基因的筛选与获取
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
Bt基因
Ti质粒
重组DNA分子
将目的基因插入染色体DNA中
从社会中来
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
1.目的基因
（1）定义：
(2)实例：
一.目的基因的筛选与获取
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
相关信息：
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理：
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
目的 培育抗虫棉
已有研究成果 ①苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害；
②苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关；
③对Bt基因的序列信息和其表达产物Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解
合适的目的基因 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程
2．筛选合适的目的基因
(1)方法：
(2)实例：
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能
3.目的基因获取方法
目的基因获取方法
从基因文库中获取
人工合成目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
一.目的基因的筛选与获取
基因组文库
部分基因文库（cDNA文库）
基因文库：
①基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
(1)从基因文库中直接获取
一.目的基因的筛选与获取
①基因组文库的构建过程
某生物所有DNA
特定的限制酶
基因组所有基因
每个基因和载体结合重组DNA分子
导入受体菌
基因组文库
一.目的基因的筛选与获取
保存的是受体菌。
(1)从基因文库中直接获取
②cDNA文库的构建过程
某种生物的成熟mRNA
单链DNA
双链DNA片段（cDNA）
导入受体菌中储存
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
与载体连接
一.目的基因的筛选与获取
保存的是受体菌。
(1)从基因文库中直接获取
2.基因组文库和部分基因文库的比较
基因组文库和部分基因文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
DNA合成仪
①前提：基因比较小、核苷酸序列已知
②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
3.目的基因的获取方法
(2)人工合成
一.目的基因的筛选与获取
化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
推测
目的基因的核苷酸序列
推测
目的基因
化学
合成
解旋：在____酶作用下，DNA两条链打开，形
成DNA单链。
引物结合：在DNA单链____端，通__________
与DNA母链结合。
DNA聚合酶结合：DNA聚合酶与模板链结合，
标志着单链合成开始。
子链合成：__________酶从引物____端开始，
将配对的脱氧核苷酸连接起来。
后续加工：将____切去，并合成空缺处的DNA
单链，再由__________酶将不连续的
DNA子链连接起来，子链和母链再形
成______结构
细胞内DNA复制过程的解析
解旋
3′
碱基互补配对
DNA聚合
3′
引物
DNA连接
双螺旋
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链
引物是指一小段DNA或RNA，它能DNA母链的一段碱基序列碱基互补配对。一般20～30个碱基。
DNA复制需要引物的原因？
子链的延伸方向？
5’到3’
PCR是_______________的缩写，是一项根据___________
________的原理，在____提供参与DNA复制的_______与_________，对____________________进行________的技术；
PCR技术：
聚合酶链式反应
DNA半保
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
一.目的基因的筛选与获取
3.目的基因的获取方法
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
留复制
原理
操作环境
目的
优点：
利用PCR，既可用来扩增已得到的基因或DNA片段，也可以用来扩增很长的DNA分子中的目的基因从而得到该基因。
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物
缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
PCR条件:
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
四种脱氧核苷酸
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
（2种）
提供相应稳定的pH环境与某些离子；
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
(dNTP)
要有一段已知目的基因的核苷酸序列
PCR技术与生物体内DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
不同点 场所
解旋方式
酶
引物
温度
能量
子链合成
结果
相同点 原则、方式
条件
子链延伸方向
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
主要在细胞核内
DNA聚合酶、解旋酶
大量的DNA片段或基因
形成整个DNA分子
一小段RNA
一般为单链DNA片段
体内温和条件
一条子链连续合成，另一条子链不连续合成
两条子链都是连续合成
ATP提供能量
dNTP提供能量
碱基互补配对、半保留复制
模板、引物、酶等
从5′端到3′端
耐高温的的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
需控制温度，在较高温度下进行
目的基因DNA__________后__________，______与单链相应互补序列结合；然后以___________为模板在____________作用下进行_____，即将4种____________加到____________，如此重复循环多次。
过程归纳：
受热变性
解为单链
引物
延伸
单链DNA
DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，即成_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
产物
模板
一倍
指数
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
3`
5`
5`
3`
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
模板DNA
目的基因
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
变性
3`
5`
5`
3`
第一轮
含有目的基因的双链DNA片段
DNA解聚为单链
温度上升到90℃以上
变性
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
退火
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第一轮
两条DNA单链
引物和两条单链DNA碱基互补配对
温度下降到50℃左右
复性
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
注意：复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率低；
②加入引物的量足够多而模板链数量少，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
92
55
75
℃
延伸
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第一轮
引物和互补DNA结合
脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则合成新的DNA链
温度上升到72℃左右
延伸
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
变性
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
退火
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
延伸
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
变性
第三轮
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
退火
第三轮
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
延伸
第三轮
一.目的基因的筛选与获取
【典例1】下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题：
(1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？
不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
(2)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
设计引物的依据是
目的基因两端的核苷酸序列
【典例1】下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题：
(3)经过第几轮扩增后，才从DNA分子中分离出目的基因？比例是多少？
第3轮；1/4。
循环n次，理论上可获得DNA 数 ，
其中含引物的DNA数 ，
含引物的DNA链数 ，
共需引物数 。
2n
2n
2n+1-2
2n+1-2
利用PCR获取和扩增目的基因
问题探讨
PCR技术获取目的基因时要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
至少3次
第一次
第二次
5’
3’
5’
3’
3’
5’
利用PCR获取和扩增目的基因
第三次
思考：继续循环N次，会得到多少个DNA分子呢？
每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
若消耗了引物62个,则进行了几轮的扩增。
5
引物数=新增单链数=2n+1-2
第四轮出现了　 　个等长的DNA片段
8
2. 第n次循环，需引物数 ，
需A引物数 ，
2n-1
T7.第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为 。　 　
15/16
T5.一个样品DNA分子经n次循环共需消耗引物a的数量为　 　．
2n-1
【例2】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
(1）第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
一.目的基因的筛选与获取
(2)两种引物的要求？ 。
①引物自身不能环化
②两种引物之间不能互补配对
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合
(3)延伸时需要加入两种引物，原因是
。
(4)两种引物与模板链的哪一端配对？脱氧核苷酸连接在引物的_____端进行延伸
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
【例2】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
一.目的基因的筛选与获取
引物的5′端与模板链3′端互补配对
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
(1)在PCR技术扩增目的基因时 （需要/不需要）解旋酶，原因是
。
(2)利用PCR技术扩增目的基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计
种引物，进行PCR时需加热至90∽95度然后冷却至55∽60度，此操作的目的是
。
【例3】如图为PCR技术扩增图解，请回答下列问题
不需要
PCR过程中是通过高温使DNA双链解聚为单链的，而不是用解旋酶
两
①90∽95度高温使DNA解聚为单链，
②然后冷却至55∽60度使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
一.目的基因的筛选与获取
(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的__________和_________，前者由________ 自动调控，后者则靠___________来维持。
（4）从理论上讲，在PCR技术中，循环4次产生的DNA分子中，第四次循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
（5）假设DNA片段有150个脱氧核苷酸对，若DNA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸有70个，则5次循环，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个（不考虑引物所对应的片段）
（6）假设DNA片段有200个脱氧核苷酸对，经3次扩增后，从理论上计算，除需要引物 个外（注：每个引物中含有20个脱氧核苷酸），还需要游离的脱氧核苷酸 个。
温度
PH值
PCR扩增仪
缓冲液
15/16
2480
2520
(2n-1)T
(2n-1)400 - 20×14
(2n+1-2)=14
一.目的基因的筛选与获取
14
一个DNA，一对引物（A与B），
通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子中等长链DNA分子数为：
______个
②子代DNA分子中不等长链DNA分子数为：_______个
③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：_______个
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个
⑤复制过程中共需引物________个
⑥第n次复制需要引物_________个
2n-2n
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
PCR扩增DNA规律
归纳总结
(7)如图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向．
(8)若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是 。
引物甲、引物丙
一.目的基因的筛选与获取
引物的5′端可以修饰。如加限制酶位点，引入突变位点等。
两种引物加不同的限制酶位点。
使DNA片段与载体能定向连接。
现学现用：
若想获得以下已知序列的DNA片段，设计了一些PCR引物，应选用的PCR引物是______(从引物①②③④中选)
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′AACTATGCGCTCATGA3′
②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′
③5′AGAGGCTACGCATTGC3′
④5′TCATGAGCGCATAGTT3′
③①
获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用
这就是需要构建基因表达载体。这也是培育转基因抗虫棉的核心工作
那么基因表达载体是由哪些部分组成的呢？
（1）目的：
（2）组成及各部分作用？
（3）目的基因的具体插入位点？基因表达载体为什么一定要有启动子？
（4）比较“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”
（5）说说基因表达载体的构建过程
获得了足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？若这样操作，效果如何？
二.基因表达载体的构建（核心步骤）
使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代
2）使目的基因能够表达和发挥作用。
非编码区
非编码区
启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录
编码区
原核生物基因
终止子：终止转录
回顾知识：基因结构：
非编码区
组成：编码区上游与编码区下游
功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
启动子：RNA聚合酶结合位点 转录起始的信号
终止子：终止RNA的合成
编码区：编码蛋白质的合成
加 工
转 录
mRNA前体
成熟mRNA
真核细胞的基因
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
补充知识：基因结构：
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因
结构一样长吗？
思考:
启动子：
位于基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
位于基因的下游,终止转录。
二.基因表达载体的构建
2.组成
便于重组DNA分子的筛选
DNA聚合酶结合位点
思考：基因表达载体为什么一定要有启动子？
启动子是RNA聚合酶的识别和结合位点，开始转录的起点，生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于目的基因的表达。
辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”
启动子与终止子位于DNA分子中，
作用：起始和终止转录过程。
起始密码子与终止密码子位于mRNA分子中，
作用：起始和终止翻译过程。
二.基因表达载体的构建
【思考】
概述基因表达载体构建的流程：
①用限制酶切割载体，使它出现一个缺口；
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因；
③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子。
目的基因
重组DNA分子
目的基因
二.基因表达载体的构建
【思考2】
①单酶切法
单酶切的方法缺陷是什么？如何避免？
用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
【思考3】
①载体与基因表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。基因表达载体在载体基础上增加了目的基因。
注意：
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。
1.转化
指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
2.转化的受体细胞
三.将目的基因导入受体细胞
受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法（常用）
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
如
①花粉管通道法
我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法
2.转化的受体细胞
（1）将目的基因导入植物细胞
三.将目的基因导入受体细胞
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
①用 将 直接注入 中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去 ，将________滴加在 上，使目的基因借助 进入 ；
受体细胞：
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
柱头
DNA溶液
花柱切面
花粉管通道
胚囊
受精卵
③花粉管通道法的过程：
注意：导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能集合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
将目的基因插入 中，通过农杆菌的_____作用，就可以使目的基因___________
农杆菌特点：
农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（___________）转移到被侵染的细胞，并且将其_________________；
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
利用农杆菌进行转化的思路：
Ti质粒的T-DNA
转化
进入植物细胞
（1）将目的基因导入植物细胞
②农杆菌转化法（常用）
初始时农杆菌转化法适用的生物及原因？
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，它能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
植物组织培养
据图可知，目的基因发生了几次拼接和导入？
过程
②农杆菌转化法（常用）
两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
②农杆菌转化法（常用）
转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片 ，然后_____________，并__________；
受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将 直接浸没在 中一段时间，然后培养植株并获得 ，再进行_____、_____等；
受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
②农杆菌转化法（常用）
显微注射法
①方法：
②受体细胞：
③过程：
受精卵
(因为受精卵容易表现出全能性)
2024/4/1
构建基因表达载体
受精卵
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
（2）将目的基因导入动物细胞
显微注射
【拓展其他方法】
（2）将目的基因导入动物细胞
科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
如
慢病毒载体、
腺病毒载体等。
腺病毒载体新冠疫苗的制备
将编码新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因组中，接种后，随载体增殖，大量所需的抗原得以表达。
接种疫苗，责无旁贷！
【拓展其他方法】
（3）将目的基因导入微生物细胞
（1）常用原核生物作为受体细胞的原因：
（2）常用处理方法及目的：
繁殖周期短
体积小易于培养操作
多为单细胞
遗传物质相对较少
Ca2+处理
（Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性）
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
（感受态细胞）
种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
导入方法
受体细胞
转化过程
【小结】
三.将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法；
花粉管通道法
体细胞或受精卵
显微注射法
将目的基因插入到 →农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞 →表达
受精卵
构建基因表达载体
受精卵
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
显微注射
Ca2＋处理法
原核细胞
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？
是否可以确定目的基因一定能够进行表达？
是否可以确定得到了新的性状？
不一定！
四.目的基因的检查与鉴定
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；
2.检测与鉴定的内容及方法:
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
病原体接种实验等
四.目的基因的检查与鉴定
1.目的:
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等个体水平鉴定
（二）鉴定——
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
（1）分子水平的检测
a.PCR等技术
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。
四.目的基因的检查与鉴定
方法：DNA分子杂交
分子杂交
b.抗原—抗体杂交技术
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
过程
【归纳总结】
四.目的基因的检查与鉴定
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
到社会中去
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
到社会中去
（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。
这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
练习与应用
二、拓展应用
1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
提示：外源基因插入基因组中可能为单位点插入。或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下。插入的位点难以做到定点插入;插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因（β-葡糖醛酸糖苷酶基因）的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
练习与应用
二、拓展应用
2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtI表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtI基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为"黄金大米"。请根据以上信息回答下列问题。
（1）科学家在培育"黄金大米"时，将crtl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是______________________，标记基因是____________，质粒pSYN12424的作用是______________________________。
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列 为什么
crtI基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
实验探究：DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
（1）DNA 片段的扩增
PCR 利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制 DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
（2）DNA 片段的电泳鉴定
① DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团
可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子
会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
② PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、 DNA 分子的大小和构象等有关。
凝胶中的 DNA 分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来。
注意：电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。即DNA分子的迁移速率与其大小成反比
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
二、材料用具
10倍浓缩的扩增缓冲液 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
（含Mg2+）
（实为dNTP）
一般使用的电泳缓冲液的pH为8,DNA分子带负电，向正极泳动。
PCR方法步骤
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 940C，5min
30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min
最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，1min
移液
离心
扩增
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
预变性：
在72℃左右时，TaqDNA聚合酶活性最高
变性温度过低，解旋不完全导致DNA不能扩增，变性温度高影响酶的的活性，在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料 （EB--溴化乙锭） 混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
电泳方法步骤
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
使DNA沉于加样孔的底部，防止DNA跑出来
注意:
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
⑤在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑥PCR扩增不能随意加大试剂用量。
基因工程的基本操作程序
结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验结果
例1：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
凝胶电泳原理与结果图

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