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第3章 基因工程
基因工程
概念：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
操作对象及环境
操作水平
操作原理
结果
生物体外
基因
DNA分子水平
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因重组
①【概念剖析】
优点？
能克服远缘杂交不亲和的障碍；
定向改造生物的遗传特性。
②基因工程理论基础的分析
【问题探究1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
（1）DNA的基本组成单位都是 。
（2）双链DNA分子的空间结构都是 。
【问题探究2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
（1） 是控制生物性状的独立遗传单位。
（2）遗传信息的传递和表达都遵循 。
（3）生物界共用一套 。
四种脱氧核苷酸
规则的双螺旋结构
基因
中心法则
遗传密码
【复习】基因的结构和功能
1.基因与DNA的关系？
2.基因的基本单位是什么？
基因是有遗传效应的DNA片段
DNA平面结构
DNA立体结构
CH2
H
OH
H
H
H
H
碱基
磷酸
5’
4’
3’
2’
1’
脱氧核苷酸
【复习】基因的结构和功能
3.基因的功能？
储存、传递、表达遗传信息
复制
子代DNA
转录、翻译
控制蛋白质合成
复制
转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
复制
蛋白质
⑴解旋：在能量的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开。
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
3'
5'
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
ATP
解旋酶
DNA复制的过程
⑵合成子链：DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
形成氢键
DNA复制的过程
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
DNA聚合酶
5'
3'
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
ATP
ATP
合成方向：
子链的5'端→ 3'端
⑵合成子链：DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。
DNA复制的过程
（3）形成子代DNA分子：每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
3'
5'
T
T
A
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5'
3'
DNA复制的过程
【从社会中来】
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
转基因番木瓜
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
培育转基因番木瓜
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
阅读教材P71，回答下列问题：
1.限制酶的来源？
2.限制酶的特点？
3.限制酶的作用部位？
4.限制酶的识别序列长度？
5.限制酶的切割结果？
问题一：如何获取人的胰岛素基因
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1、来源：
主要从原核生物中分离纯化来的
2、种类：
数千种
3、特点 :
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
4、识别序列长度 :
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数4个、8个或其他数量
5、限制酶作用部位:
特定切点上的磷酸二酯键
特定部位的磷酸二酯键
限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
识别序列？
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；
EcoRⅠ
SamⅠ
TaqⅠ
5’…T-C-G-A…3’
3’…A-G-C-T…5’
也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
特点1：都可以找到一条中（心）轴线；
特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致
6、限制酶切割结果:
（1）实例1——EcoRⅠ限制酶切割
*EcoRⅠ识别序列为GAATTC
*EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键
黏性末端
黏性末端
*形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____
AATT
（2）实例2——SmaⅠ限制酶切割
*SmaⅠ识别序列为CCCGGG
*SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键
平末端
【练习1】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________
HindⅢ ________ BglⅡ ________
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？
不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端
【练习2】：教材P74课后题拓展应用2
有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：
哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？
XbaⅠ
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）
【练习3】请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。
3
①
②
③
【练习4】请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
（1）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能
（2）请结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水。
限制酶只能识别并切开双链DNA分子
两
2
2
两
【练习5】下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：
（1）用EcoR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段；
（2）用PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（3）同时用SmaⅠ 和PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（4）只用PstⅠ 酶切，最多能得到 种DNA片段。
2
3
5
5
【P71旁栏思考题】限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用。
原核细胞DNA中不存在限制酶的识别序列或能被识别的序列被修饰了。
【P74拓展应用1】为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
思考：如何将人胰岛素基因与大肠杆菌DNA相连接
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
什么样的末端才能连接起来？，
1. 作用：
2. 种类：
⑴ E·coli DNA连接酶
⑵ T4 DNA连接酶
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·coli DNA连接酶的缝合作用
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接黏性末端
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
CTTCATG
GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA
GGGATT
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
TCTTCATG
AGAAGTACTTAA
AATTCCCTAAG
GGGATTC
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
E·coli DNA连接酶在基因工程中的应用
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
种类 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源
连接末端类型
共性
大肠杆菌
T4噬菌体
只能连接黏性末端
即可连接黏性末端，又可连接平末端
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
回顾：DNA聚合酶的作用
归纳：比较DNA连接酶和DNA聚合酶
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不 同 点 作用 实质 催化 加到已有脱氧核苷酸链片段上，形成 . 催化两个 之间形成 .
作用 结果 催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子 催化具有 黏性末端或平末端的 连接起来，形成 .
模板 . .
相同点 ①化学本质都是蛋白质； ②都是催化形成 .
单个脱氧核苷酸
磷酸二酯键
两个DNA片段
磷酸二酯键
磷酸二酯键
需要
不需要
互补
DNA片段
重组DNA分子
根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶
b
a
1.切断a处的酶为_______
2.连接a处的酶为_______
3.切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
反馈练习：
【核心归纳】与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用 部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用 对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA
作用 结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
DNA酶
载体种类：
质粒、噬菌体、动植物病毒等
三、基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
任务：分析归纳载体需要具备的条件：
问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？
问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；
条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
条件④：载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害。
三、基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
大肠杆菌及质粒结构模式图
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
三、基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
①作为运输工具，将外源基因导入受体细胞。
②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
【核心探讨】标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GCCGTATG…
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
实例： 重组DNA分子的模拟操作
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
GCCGTATG…
思考讨论：
1.剪刀和透明胶带或订书针分别代表哪种“分子工具”？
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
练习与应用
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 噬菌体、动植物病毒
小结
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
思考：
1.插入载体的这段DNA片段能称得上一个基因吗？
2.从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割___次此DNA分子，产生____个末端,出现____个游离的磷酸基团
3.目的片段翻转过来，可以连接吗？____
4.目的片段可以自身环化吗？_____
4.切割目的基因和载体时，需要用____限制酶,目的是_________________
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上
2
4
4
同种
产生相同的黏性末端
*一定是同一种限制酶吗？
可以
可以
拓展练习：
下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子？
（注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因）
HindⅢ和PstⅠ
防止目的基因的自身环化
防止目的基因反向连接到载体

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