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本节聚焦
第2节　微生物的培养技术及应用
　一　微生物的基本培养技术
什么是培养基？如何配制？
什么是无菌技术？
怎样进行酵母菌的纯培养？　
第1章　
发酵工程
　　 向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。
　　　从社会中来
　　那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
　　应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
　　防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
　　1．培养基的概念
　　人们按照微生物对＿＿＿＿＿＿的不同需求，配制出供其　＿＿＿＿＿的营养基质。
　　2．培养基的用途
　　用以＿＿＿、＿＿＿、＿＿＿、保存微生物或积累其代谢物。
营养物质
生长繁殖
　　 一、培养基的配制　　　
培养
分离
鉴定
　　相关信息
　　微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物。
放线菌
　　3．培养基的常见类型（按物理性质分）
　　（1）液体培养基
　　不含＿＿＿＿（如琼脂）、呈液体状态的培养基。
　　（2）固体培养基
　　呈固体状态的培养基。
　　 一、培养基的配制　　　
凝固剂
琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。
琼脂固体培养基是实验室中最常用的培养基之一
长有酵母菌菌落的固体培养基
液体培养基
　　4．培养基的配方
　　（1）主要营养物质　　　　　　　　　
　　水、＿＿＿、＿＿＿、＿＿＿＿等。　　
　　 一、培养基的配制　　　
碳源
氮源
无机盐
组　分 含　　量 提供的主要营养物质
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
H2O 定容至1000mL 水
特殊营养物质
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧
微生物
特殊需求 添加 ＿＿＿ pH调至______ pH调至 _________ _________ 无氧
维生素
酸性
中性或
弱碱性
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成
（2）其他条件
pH、＿＿＿＿＿＿、O2的需求
例如：
碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
碳源、氮源和维生素等
无机盐
提供碳元素的物质
提供氮元素的物质
　　思考
　　1．下表是某培养基的配方，分析回答：
　　 一、培养基的配制　　　
材料 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 定容至1000 mL
　　（1）该培养基中提供碳源和氮源的物质是什么？为什么培养基需要氮源？
　　提示：该培养基中牛肉膏和蛋白胨提供碳源和氮源。
　　培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质必需的。
　　思考
　　1．下表是某培养基的配方，分析回答：
　　 一、培养基的配制　　　
材料 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 定容至1000 mL
　　（2）该培养基培养的微生物同化作用类型是______________，理由是什么？
　　该微生物的碳源和氮源是有机物。
异养型微生物
　　思考
　　2．培养微生物时，培养基中是否必须有碳源和氮源？
　　提示：不一定。例如，培养自养型微生物时，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空气中的CO2；培养固氮微生物时，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空气中的N2。
　　 一、培养基的配制　　　
　　思考
　　3．下表是某微生物培养基的成分，请分析该培养基可用来培养哪种微生物？若除去①，此培养基可用来培养圆褐固氮菌吗？
　　 一、培养基的配制　　　
　　提示：此培养基可用来培养自养型微生物。
　　若除去①圆褐固氮菌虽可以固氮，但其同化作用类型为异养型，培养基中必须提供含碳有机物，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌。
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0．4 g 4．0 g 0．5 g 0．5 g 100 mL
　　归纳提升——几种微生物的营养和能量来源
即 时 巩 固
　　1．下列有关培养基的叙述，错误的是（　　）
　　A．微生物的培养都需要提供水、有机碳源、有机氮源、无机盐，缺一不可
　　B．微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的菌落
　　C．在培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性
　　D．培养基既能培养细菌，也能培养真菌
A
即 时 巩 固
　　2．不同的微生物对营养物质的需求各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养型微生物所需营养的描述中，错误的是（　　）
　　A．氮源物质为该微生物提供必要的氮元素
　　B．碳源物质也是该微生物的能源物质
　　C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
　　D．水是该微生物的营养要素之一
B
　　实验室培养微生物条件
　　①提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
　　②确保其它微生物无法混入　　
　　 二、无菌技术　　　
——无菌技术
——培养基
　　1．目的
　　（1）防止培养物被污染。
　　（2）防止＿＿＿＿＿＿＿＿。
　　2．操作类型
　　（1）消毒
　　消毒是指使用较为＿＿＿的物理、化学或生物等方法杀死物体＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿微生物。
　　（2）灭菌
　　灭菌是指使用＿＿＿的理化方法杀死物体＿＿＿＿＿＿微生物，包括芽孢和孢子。
温和
　　 二、无菌技术　　　
感染实验操作者
表面或内部一部分
强烈
内外所有的
　　相关信息
　　芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体(不是繁殖体)，叫作芽孢。
　　孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
霉菌的孢子生殖
环境适宜
　　 资料卡　　　　常用的消毒和灭菌方法　　　
项　　目 主要方法 应用范围
消 毒 巴氏消毒法 63～65 ℃消毒＿＿＿min或72～76 ℃处理＿＿＿s或80～85 ℃处理＿＿＿＿s ＿＿＿、啤酒、果酒和酱油等不耐高温的液体
煮沸消毒法 100 ℃煮沸＿＿＿min 家庭餐具等生活用品
紫外线消毒 紫外线照射＿＿＿min
化学药物消毒 用体积分数为70%～75%的＿＿＿、＿＿＿、苯酚或煤酚皂溶液等处理 皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、水消毒
牛奶
30
15
5～6
30
氯气
接种室、接种箱或超净工作台
酒精
10～15
项　　目 主要方法 应用范围
灭 菌 灼烧灭菌 　 直接在酒精灯火焰的 　 ＿＿＿＿＿层灼烧
干热灭菌 干热灭菌箱中，160～170 ℃的热空气中维持1～2h。
高压蒸汽灭菌 （湿热灭菌） 100 kPa、121 ℃的条件下，维持15～30 min
充分燃烧
接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具、试管口或瓶口等
培养基等
耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金属用具等
　　 资料卡　　　　常用的消毒和灭菌方法　　　
干热灭菌箱
高
压
蒸
汽
灭
菌
锅
即 时 巩 固
　　3．在微生物的培养和分离实验操作中，无菌操作是实验成功的关键，下列可能造成污染的措施是（　　）
　　A．实验操作者双手用体积分数为70%的酒精消毒
　　B．试管高压蒸汽灭菌时加脱脂棉花
　　C．在超净台上完成操作
　　D．接种环需要灼烧灭菌
B
即 时 巩 固
　　4．防止外来杂菌的入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是（　　）
　　A．实验室里可以用紫外线或化学药剂进行消毒
　　B．接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
　　C．在实验室中，切记不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，防止被微生物感染
　　D．使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境
B
　　1．培养物
　　在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。　　
　　2．纯培养物
　　由＿＿＿＿＿＿繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
　　3．纯培养
　　获得＿＿＿＿＿＿的过程就是纯培养。
　　4．纯培养的步骤
　　＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿等步骤。
　　 三、微生物的纯培养　　　
单一个体
纯培养物
配制培养基、灭菌、接种、分离和培养
　　1．实验原理
　　微生物群分散或稀释成单个细胞，单个细胞繁殖成单个菌落。　　
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
属于纯培养物
平板划线法
稀释涂布平板法
　　分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
　　2．目的要求
　　（1）学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。
　　（2）学会进行无菌操作。
　　（3）尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
　　3．材料用具（略）
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
倒平板
平板划线
　　4．操作步骤
　　（1）制备培养基
　　①配制培养基
　　称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
　　②灭菌
　　将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入＿＿＿＿＿＿＿＿中灭菌15～30min 。
　　将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入＿＿＿＿＿＿＿内灭菌2h。
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
高压蒸汽灭菌锅
干热灭菌箱
　　③倒平板
　　待培养基冷却至50℃左右时，在＿＿＿＿＿＿＿附近倒平板。
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
酒精灯火焰
c．用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20 mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
b．将瓶口迅速通过火焰。
a．拔出锥形瓶的棉塞。
d．等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
　　思考
　　4．结合倒平板的操作程序，请回答：
　　
　　
　　（1）如图一所示，为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
　　提示：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
　　（2）如图二所示，从防止杂菌污染的角度思考，为什么培养基冷却凝固后将平板倒置？
　　提示：可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成杂菌污染。
　　4．操作步骤
　　（2）接种和分离酵母菌
　　①接种：指在无菌条件下将微生物或含菌材料转移到合适其生长繁殖的培养基中的过程。
　　②分离酵母菌
　　方法：平板划线法。
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
　　通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
　　平板划线法的操作步骤
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
　　 ①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
　　
　　②在＿＿＿＿冷却接种环，并拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。
　　③将试管口通过＿＿＿。
火焰旁
火焰
　　平板划线法的操作步骤
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
　　 ④将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液。
　　
　　⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞 。
　　⑥在＿＿＿附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。
火焰
　　平板划线法的操作步骤
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
　　 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的＿＿＿开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与＿＿＿＿＿＿＿相连。
末端
第一次划线
　　（3）培养酵母菌
　　完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 28℃ 左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养 24 ~ 48h。
　　5．结果分析与评价
　　1．在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
　　在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。
　　2．在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
　　在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑、多呈乳白色。
　　若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液中混入了其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染。
　　思考
　　4．除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？
　　使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
　　思考
　　5．为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？请完善下方的表格。
　　 探究·实践　　　　酵母菌的纯培养　　　
灼烧时期 目　　　　　　的
取菌种前 杀死接种环上______________
每次划线前 杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于________________，从而使____________________________，直至得到__________
接种结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌_______________________
原有的微生物
上次划线的末端
每次划线时菌种数目逐渐减少
单个细菌
污染环境和感染操作者
　　归纳提升——平板划线操作的注意事项
　　（1）蘸取菌液前及每次划线后都需灼烧接种环，划线操作结束后仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的不完全相同。
　　（2）灼烧接种环后，要等其冷却后才能伸入菌液中或进行划线，以免温度过高而杀死菌种。
　　（3）最后一次的划线不要与第一次的划线相连，否则无法达到纯化效果。
　　（4）划线时的力度大小应适宜，防止因用力过大而将培养基划破。
　　（5）接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰；划线操作全程都要在酒精灯火焰旁进行。
即 时 巩 固
　　5．下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是（　　）


　　A．步骤①后需将培养基灭菌并调节pH
　　B．步骤①②③操作时需要在酒精灯火焰附近进行
　　C．步骤③到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次
　　D．图中步骤①结束后需倒置平板，④结束后不需要
B
即 时 巩 固
　　6．在分离纯化大肠杆菌实验中，划线接种（甲）、培养结果（乙）如图所示。有关叙述错误的是（　　）


　　A．甲中a区域为划线的起始位置
　　B．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌
　　C．接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
　　D．连续划线的目的是获得单个细菌，以便形成单菌落
A
即 时 巩 固
　　7．下列关于“酵母菌的纯培养”实验的叙述，错误的是（　　）
　　A．马铃薯捣烂后的滤液中含有酵母菌生长所需的多种营养成分
　　B．接种环灭菌时，顶端的环和环后的部分柄均需通过火焰灼烧
　　C．平板划线时，接种环应在固体培养基表面轻轻地连续划线
　　D．完成平板划线后，应将平板立刻倒置培养以免污染培养基
D
　 　P14　练习与应用
　　一、概念检测
　　1．微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
　（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
　 （2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
　 （3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）



　 　P14　练习与应用
　　一、概念检测
　　2．日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
　　提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。
　　干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
　 　P14　练习与应用
　　二、拓展应用
　　1．某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
　　（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
　　（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
　　接种。
培养皿和培养基
　 　P14　练习与应用
　　二、拓展应用
　　1．某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
　　（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
　　提示：通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
　 　P14　练习与应用
　　 2．某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
　　（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
　　意味着培养液中02含量不同。
　　（2）从图中数据你可以得出什么结论？其原因是什么？
　　培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
　　（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定？
　　提示：这时候已经达到了环境容纳量。
　
思维导图 晨读必背
　　1．获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
　　2．消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
　　3．由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
　　4．菌落是分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部繁殖形成的肉眼可见的，有一定形态结构的子细胞群体。
作业：完成课后相关练习
评估论点的可信程度
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
“酵素”是什么？水果“酵素”的制作原理是什么？水果“酵素”中可能含有哪些成分？它是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？水果“酵素”中的所有成分都有益于人体健康吗？
如果要更加有力地支持或反驳水果“酵素”有益健康的论点，应该怎样获取证据？

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