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(共25张PPT)
1.2微生物的培养技术以应用
二微生物的选择培养和计数
从社会中来
PCR需要耐高温的DNA聚合酶，到哪里寻找？你有什么思路吗？
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
从社会中来
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。
【思考】为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
这是因为水生栖热菌能在 70-80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
想一想，以上例子给我们在分离纯化微生物带来什么启示？
一、选择培养基
1.实验室中筛选特定微生物的原理：
人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2.选择培养基的定义：
一、选择培养基
长出各种各样的细菌
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
想一想，如何证明培养基加入氨苄青霉素后是否筛选出了一些菌落？
一、选择培养基
3.选择培养基配方的设计：
(1)添加某些化学物质。
例：培养基中加入抗生素——筛选出酵母菌、霉菌等真菌
培养基中加入高浓度食盐——筛选金黄色葡萄球菌
(2)提供特定培养条件
例：70～80℃的高温——水生栖热菌
选择培养基配方的设计
一、选择培养基
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］是现代农业生产中一种重要的氮肥,施入土壤后，会被土壤中的某些细菌(能合成脲酶)分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
讨论1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源。
讨论2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
一、选择培养基
3.选择培养基配方的设计：
(1)添加某些化学物质。
例：培养基中加入抗生素——筛选出酵母菌、霉菌等真菌
培养基中加入高浓度食盐——筛选金黄色葡萄球菌
(2)提供特定培养条件
例：70～80℃的高温——水生栖热菌
(3)以特定物质作为唯一碳源或氮源
例：培养基中尿素为唯一氮源——筛选出尿素分解菌
培养基中纤维素为唯一碳源——筛选纤维素分解菌
【问题1】若想知道土壤中有多少能够分解尿素的细菌，该如何操作？
二、微生物的选择培养
计数：测定分解尿素的细菌的数量
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
【问题2】由于土壤细菌的数量庞大，那么怎么获得想要得到的特定微生物的纯培养物呢？
对土壤进行充分稀释后，再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
稀释涂布平板法
——将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
梯度稀释菌液
涂布平板
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
二、微生物的选择培养
稀释涂布平板法
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在选择培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
二、微生物的选择培养
稀释涂布平板法
培养:待涂布的菌液被选择培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃培养1～2d。
观察:在适宜稀释度的平板上可以分离得到单菌落。
二、微生物的选择培养
1.稀释涂布平板法除可以用来分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
三、微生物的数量测定
(1)原因：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
(2)计数方法：
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
每克样品活菌数=（菌落数/菌液体积）*稀释倍数
三、微生物的数量测定
(3)影响因素：
在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30-300、适于计数的平板。
(4)减少误差的操作：
在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
样品的稀释度
1.稀释涂布平板法除可以用来分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
三、微生物的数量测定
(5)结果分析：
统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
【思考】统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，为什么？
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
1.稀释涂布平板法除可以用来分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
三、微生物的数量测定
(6)举例：
【计算】若土样稀释105倍，取0.1mL涂布在三个平板上，培养后三个平板上的菌落数依次为46、47、54。求每克土样中有多少分解尿素的细菌。
1.稀释涂布平板法除可以用来分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法除可以用来分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
2.利用显微镜进行直接计数。
细菌计数板或血细胞计数板
统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
血细胞计数板（厚、深）
细菌计数板（薄、浅）
三、微生物的数量测定
2.利用显微镜进行直接计数。
三、微生物的数量测定
三、微生物的数量测定
【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
碳源
氮源
①提供无机盐；
②调节pH。
凝固剂
三、微生物的数量测定
【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
结果分析与评价
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为完全培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；
②整个实验还要设置2个平板：不涂布稀释液的选择培养基和完全培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。
三、微生物的数量测定
【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
结果分析与评价
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
三、微生物的数量测定
【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
结果分析与评价
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
三、微生物的数量测定
【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
（1）原理：细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
（2）方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。
三、微生物的数量测定
【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
（2）方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。

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