资源简介

(共21张PPT)
第2节 微生物的培养技术及应用　
第1章　发酵工程
选择性必修三
1.举例说明各类微生物都能适应其生活环境，通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 —生命观念
2.根据微生物的代谢类型配制选择培养基。 —科学探究
3.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法，讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的方法。 —社会责任
二 微生物的选择培养和计数
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办？
1.获得纯净的微生物培养物的关键是什么？
防止杂菌污染
2.微生物的纯培养过程包括哪些步骤？
配制培养基、灭菌、接种、分离和培养
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。
（1）.为什么水生栖热菌能更容易在热泉中找到并被筛选出来呢？
这是因为水生栖热菌适应热泉的环境，能在 70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
（2）.在自然界中，想进行微生物筛选的原则是什么？
耐热微生物
耐寒微生物
石油分解菌
根据微生物对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。
一、选择培养基
1.科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
2.筛选原则：
美国黄石公园
实验室中目的 菌株怎么筛选？
一、选择培养基
(1).概念：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
3.选择培养基
(2)类型
①依据营养需求
自养微生物（硝化细菌等）
不添加氮源
不添加碳源
固氮微生物（圆褐固氮菌等）
以石油为唯一碳源
能分解石油的微生物
以尿素为唯一氮源
能分解尿素的微生物
②加入某种化学物质
加入青霉素（抑制细菌和放线菌的生长）
分离酵母菌、霉菌等真菌
③利用特殊环境
置于无氧环境
厌氧型（乳酸菌）和兼性厌氧型微生物（酵母菌）
置于高盐环境
金黄色葡萄球菌
置于高温环境
耐高温微生物
思考：那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
选择培养基配方的设计
思考·讨论
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥。尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，来催化尿素分解成NH3,NH3可作为细菌生长的氮源。
尿素分子模型
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
讨论
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
该培养基与普通培养基相比，区别只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
一、选择培养基
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
完全培养基
选择培养基
二、微生物的选择培养
思考：如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌该进行什么操作：
获得分解尿素的细菌的纯培养
第一步：分离纯化
第二步：计数
测定分解尿素的细菌的数量
需要对土样进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法——稀释涂布平板法
1.稀释涂布平板法
(1)概念：
将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
（2）基本操作：a.梯度稀释； b.涂布平板。
（3）工具：涂布器
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
二、微生物的选择培养
（4）.操作过程：
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
注意：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
微量
移液器
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃恒温箱培养。
二、微生物的选择培养
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d。
稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，
稀释涂布平板操作后分离得到单菌落
也常用来统计样品中活菌的数目。
二、微生物的选择培养
培养与观察：
恒温培养箱
二、微生物的选择培养
通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
接种环
涂布器
从最后划线的区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数
①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。
2.平板划线法和稀释涂布平板法的比较：
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法：——间接计数法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目
（2）计数原则：
①一般选择菌落数为30～300的平板计数；
②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
③适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
注意：
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法：——间接计数法
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；
每克样品中的菌落数＝(C/V)×M
M代表稀释倍数；
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
（4）计算公式：
（3）结果分析：
②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
例：甲同学在稀释倍数为105获得5个平板，菌落数分别是10、80、90、100、350，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
三、微生物的数量测定
2.显微镜直接计数：——直接计数法
（1）方法：
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
相关信息
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数，血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的观察和计数。
（2）优点：
快速直观
（3）缺点：
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
每毫升原液所含细菌数＝
怎么算每小格平均细菌数？
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。
每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
血细胞计数板
观察到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数＝红细胞含量/细菌含量
三、微生物的数量测定
探究·实践
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
①从物理性质看该培养基属于什么培养基？
②从功能分析该培养基属于什么培养基？
固体培养基
选择培养基
三、微生物的数量测定
探究·实践
（2）.实验步骤：
1）土壤取样
①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。
②取样过程：
3）样品稀释与取样涂布
2）制备培养基
①细菌：一般用104、105、106稀释液。
②真菌：一般用102、103、104稀释液。
以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
相当于做预实验。
铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布 在距地表3～8cm的土壤层。
思考
三、微生物的数量测定
探究·实践
（2）.实验步骤：
4）微生物的培养与观察
①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。（鉴别指示剂）
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
三、微生物的数量测定
探究·实践
（3）结果分析与评价
a.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
b.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
三、微生物的数量测定
探究·实践
（3）结果分析与评价
实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落，分析其原因。
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
c. 你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
原因：（1）土样不同（2）培养基污染或操作失误
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
三、微生物的数量测定
探究·实践
（4）进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌就是能够分解尿素的细菌。
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况；
固体培养基：
①原理：
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
→ 酚红变红
②方法：
三、微生物的数量测定
探究·实践
在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
鉴别培养基：
拓展应用
纤维素分解菌的鉴定
（1）筛选纤维素分解菌的方法____________。该方法可以通过____反应直接筛选。
刚果红染色法
颜色
（2）原理：
刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌

展开更多......

收起↑