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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
第一章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
第1课时 微生物的基本培养技术
从社会中来
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术。
失败
一、微生物
1. 微生物的概念：微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。
（1）无细胞结构（病毒）：SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；噬菌体等DNA病毒。
新冠病毒
噬菌体
人类免疫缺陷病毒
1. 微生物的概念：微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。
（2）原核细胞：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌、醋酸菌等细菌；链霉菌等放线菌。
蓝细菌
乳酸菌
醋酸菌
链霉菌
1. 微生物的概念：微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。
衣藻
本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
②原生生物：草履虫、变形虫、衣藻等。
①真菌：酵母菌、霉菌、毛霉等；
酵母菌
毛霉
草履虫
（3）真核细胞
变形虫
（1）防止杂菌污染；
（2）获得纯净的微生物培养物。
2. 研究和应用微生物的前提（发酵工程的重要基础）
3. 实验室培养微生物的要求
（1）为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件—培养基
（2）确保其它微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来—无菌技术
高压蒸汽灭菌
培养基
二、培养基的配制
1. 培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
2. 培养基的分类按(物理性质分类)
（1）液体培养基：不含凝固剂（如琼脂）、呈液体状态的培养基。
（2）固体培养基：呈固体状态的培养基。
①液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基是实验室最常用的培养基之一。
注意：凝固剂（如琼脂），不能被微生物利用，只起到凝固作用。
2. 培养基的分类
液体培养基
加入琼脂
琼脂固体培养基
②微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。
1. 定义：单个或少数同种菌体在固体培养基上大量繁殖，形成肉眼可见的子细胞群体。
2. 特征：形状、大小、颜色、光泽度、透明度等。
3. 功能：菌落是鉴定菌种的重要依据。
知识补充：菌落
沙门氏菌
毛霉
青霉菌
酵母菌
3. 培养基的营养构成
（1）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。
1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
注：牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
思考（P10）：为什么培养基需要氮源？
氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质必须的元素。
微生物的化学组成大体相同，主要由C、H、O、N、P、S等大量元素和Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo等微量元素组成，这些元素最终来自外界环境中的各种有机物和无机物。
思考：为什么各种培养基的具体配方不同，但一般都有水、无机盐、碳源和氮源？
3. 培养基的营养构成
提供碳元素的物质
提供氮元素的物质
3. 培养基的营养构成
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素
由于缺乏合成这些物质所需的酶或合成能力有限
（2）培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ；
②培养霉菌时，需要将培养基调至 ；
③培养细菌时，需要将培养基调至 ；
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
3. 培养基的营养构成
三、无菌技术
消毒
灭菌
1. 获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术应围绕着如何避免杂菌污染展开。
二、无菌技术
二、无菌技术
2. 无菌技术的类型
（1）消毒
①概念：使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
②适用对象：对操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
（2）灭菌
①概念：使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
②适用对象：用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
芽孢指某些细菌（如芽孢杆菌等）在一定条件下细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。如某些细菌的芽孢煮沸3小时才死亡。每个细菌仅形成一个芽孢。
孢子指细菌、真菌、原生动物和植物等产生的一种有繁殖作用的生殖细胞。正常情况下不需要两两结合就可以由单个细胞直接发育成新个体。
知识拓展
3. 常用的消毒和灭菌方法
（1）常用的消毒方法
*：照射前适当喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。
3. 常用的消毒和灭菌方法
（1）常用的消毒方法
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药物消毒法
紫外线消毒法
消毒方法
超净工作台
相关信息（p10）：生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。例如有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方式。
高压蒸汽灭菌锅
易错提醒
高压蒸汽灭菌的2个注意点
（1）高压蒸汽灭菌开始之前要将锅内的冷空气排尽。因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
（2）灭菌完毕后，要待压力降到0时才能打开排气阀。否则会导致锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
干热灭菌箱
干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h。
充分燃烧层
（外焰）
灼烧灭菌：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧。
接种针
接种环
涂布器
4. 防止杂菌污染的措施
（1）实验前：
①对操作空间、操作人员消毒；
②对所用器皿、接种用具和培养基灭菌。
①避免已灭菌处理材料用具与周围物品接触造成污染；
②为避免周围微生物污染，实验操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。
（2）操作时：
P10旁栏思考：
无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
还能有效避免操作者自身被微生物感染。
4. 防止杂菌污染的措施
（3）实验后：
使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
干热灭菌
灼烧灭菌
化学药物消毒（酒精）
紫外线消毒
巴氏消毒法
【巩固练习】以下所采用的灭菌或消毒方法依次是
化学药物消毒（次氯酸钠）
培养基
培养皿
接种环
实验操作者的双手
实验室
牛奶
有活性生物材料
四、微生物的纯培养
1
2
3
4
5
1. 培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体成为培养物。
（一）相关概念
3. 纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养，包括制备培养基（包括配制培养基、灭菌、倒平板）、接种、分离和培养等步骤。
2. 纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
（二）酵母菌的纯培养
不同菌落的大小、形状、光泽度、颜色等不同。
1. 纯培养的原理
（1）分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落（菌落属于种群）。
（2）采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散到固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
微生物群
分散
单个细胞
单个菌落
繁殖
2. 目的要求
（1）学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。
（2）学会进行无菌操作。
（3）尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
（二）酵母菌的纯培养
酵母菌菌落：
湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的菌落大而厚。
①配制培养基：称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g
琼脂，用蒸馏水定容至1000ml（定容）。
（1）制备培养基
（二）酵母菌的纯培养
3. 方法步骤
②灭菌：
将配制好的培养基（湿热灭菌）转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。
将5-8套培养皿（干热灭菌）包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。
（1）制备培养基
（二）酵母菌的纯培养
3. 方法步骤
Ⅰ. 拔出锥形瓶的棉塞。
Ⅱ. 将瓶口迅速通过该火焰。
Ⅲ. 用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10-20ml）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
Ⅳ. 等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
（1）制备培养基
③倒平板：待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
2. 倒平板要在酒精灯火焰附近进行？
思考 · 讨论
防止空气中微生物污染。
3. 将瓶口迅速通过火焰？
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
1. 如何估计培养基的温度（50℃左右）？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
6. 怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
5. 平板冷凝后，要将平板倒置？
思考 · 讨论
防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4. 倒平板时不能将培养皿完全打开？
防止空气中杂菌污染。
（1）培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时才能倒平板，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。
（2）整个操作在酒精灯火焰旁附近进行，避免周围环境中微生物的污染。
（3）平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
倒平板的注意事项
（4）倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
（5）将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
倒平板的注意事项
2. 接种和分离酵母菌
（1）平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
分散或稀释
生长繁殖
单菌落
（2）平板划线法的具体操作
2. 接种和分离酵母菌
①将接种环放在火焰
上灼烧，直到接种环
的金属丝烧红。
②在火焰旁冷却接种
环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。
③将试管口通过火焰（灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基）。
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。
（2）平板划线法的具体操作
2. 接种和分离酵母菌
1. 在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
2. 为什么每次划线之前都要灼烧接种环？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
思考 · 讨论
第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物。
第二次及以后划线前：杀死上次划线时残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端。
3. 划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？
杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。
思考 · 讨论
4. 划五次线，接种环需要灼烧几次？
第1次划线
接种环灭菌
第2次划线
接种环灭菌
第3次划线
接种前接种环灭菌
接种环灭菌
第4次划线
接种环灭菌
第5次划线
接种环灭菌
需要灼烧6次。
5. 第二次及以后的划线时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
6. 为什么不能将最后一次的划线与第一次的划线相连？
将聚集的菌种逐步稀释，以便获得单菌落。
线条末端酵母菌的数目比起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到单菌落。
思考 · 讨论
菌种经数次划线后培养，分离得到单菌落。
第一次划线酵母菌数量多，最后一次划线酵母菌数量少，首尾相连，不容易得到单个菌落。
①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物。
②第二次及以后划线前：杀死上次划线时残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端。
③划线结束后：杀死接种环残留菌种，避免污染环境和感染操作者。
（1）接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。
平板划线法的注意事项
（2）灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种。
（3）接种环的灼烧：
（6）划线时，最后一次的划线不要与第一次的划线相连。
平板划线法的注意事项
（4）划线五次，接种环需要灼烧6次。
（5）第二次及以后的划线时，要从上一次划线的末端开始划线，为了将聚集的菌种逐步稀释，以便获得单菌落。
思考1：为什么要将平板倒置？
思考2：为什么要同时放入一个未接种的平板？
可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
作对照，检验培养基灭菌是否彻底或是否被杂菌污染。
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24-48 h。
3. 培养酵母菌

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