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1.1 微生物的培养需要适宜条件
微生物概述
微生物的概念：
_______________________________ 的统称。
包括_______________________________等。
本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
形体微小、肉眼不可见的生物
细菌、真菌、病毒及一些原生生物
禽流感病毒
SARS病毒
大型真菌
病 毒
原核生物(细菌)
真 菌
原生生物
◆微生物的共同特点：
个体微小、结构简单
19世纪中期，法国酿酒业曾一度遭到毁灭性打击，葡萄酒出现了变酸变味的怪事...
[法国]巴斯德发现，导致生产失败的根源在于发酵物中混入了微生物。
细菌、真菌、病毒、原生动物等
由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，但成功率低，食用后导致肠胃不适的事件屡见不鲜。
原因分析：
制作过程中有杂菌混入
怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物？
制作工具和原料灭菌
接种纯的菌种
控制发酵条件
避免杂菌进入
微生物的基本培养技术
如何获得纯净培养物？
①合适的营养和环境条件
②确保其他微生物无法混入
培养基
无菌技术
思考探究
1、细胞内的化合物有哪些？
2、细胞内的化合物是怎么获得的？
所以，培养微生物时培养基中应该加入哪些物质呢？
⑴成分：
水、无机盐、碳源、氮源、（生长因子）
a.碳源
无机碳源：
有机碳源：
CO2
酵母提取物、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
b.氮源
无机氮源：
有机氮源：
N2、NH3、NH4＋、NO3-等
酵母提取物、蛋白胨、尿素等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源
2、培养基的成分：
固氮菌
硝化细菌
1、概念
人们为满足微生物 的需求而配制的混合养料
生长繁殖或积累代谢产物
一、 培养基
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
一、 培养基
酸性
碱性
无氧
喜荤
喜素
3、培养基的能量来源：
自养微生物
异养微生物
4、培养基的理化特征影响微生物的生长：
常用蛋白胨和酵母提取物等配制
常用可溶性淀粉加无机物配制，或用添加蔗糖的豆芽汁等配制
细菌喜荤，霉菌喜素
细菌喜碱，霉菌喜酸
配置100ml
LB培养基的配方
配置1L
马铃薯蔗糖培养基的配方
细菌通用
真菌(霉菌)通用
固体培养基
液体培养基
（1）物理性质：
一、 培养基
5、培养基的类型：
有无 凝固剂琼脂
琼脂是由海藻中提取的多糖体,其特点是具有凝固性、稳定性等物理化学性质.广泛用于制造粒粒橙及各种饮料、果冻、冰淇淋、糕点、软糖、罐头、肉制品、八宝粥、银耳燕窝、羹类食品、凉拌食品等等。
一、 培养基
液体培养基
大规模快速繁殖某种微生物，工业生产
平板
斜面
微生物的分离、鉴定、活菌计数
菌种保存
固体培养基
固体培养基
单个微生物在固体培养基表面形成的具有一定形态结构的子细胞群体。
一个种群
菌落
合成培养基：成分明确；
天然培养基：成分不明确；用于工业生产。
天然培养基：
培养多种细菌的牛肉膏蛋白胨培养基，
培养酵母菌的麦芽汁培养基等。
一、 培养基
合成培养基：
高氏1号（常用于培养、分离放线菌）
成分：可溶性淀粉20g、KNO3 1g、NaCl 0.5g、K2HPO4·3H2O 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15 ~ 20g，蒸馏水1000mL,pH 7.2~7.4。
一、 培养基
LB液体培养基的组成成分
LB培养基是一种培养基的名称
天然培养基（成本低）
思考回答
1、培养基的配置有何要求？
2、细菌和霉菌的培养分别有何特性？
3、获得纯净培养物的关键是？
（一）目的
对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ；
将培养器皿、接种用具和培养基等进行 灭菌 ；
为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；
避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。
防止外来杂菌的入侵（非目标微生物的干扰）
二、 无菌技术
（二）主要内容
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体。芽孢的壁很厚，对干旱、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。
芽孢
高压蒸汽灭菌
二、 无菌技术
1.灭菌：
用强烈的理化因素杀死物体内外“所有”微生物（包括芽孢和孢子）
⑴高压蒸汽灭菌 ⑵干热灭菌 ⑶灼烧灭菌
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。
优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。
对象：培养基、培养皿等
基本保持培养基的营养成分不被破坏
特别注意：
使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境
(1)高压蒸汽灭菌法：
高压蒸汽灭菌锅
121℃ 1Kg/cm2压力 10--20min
高压蒸汽灭菌锅
灭菌后，通常将实验用具放入60~80℃的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。
二、 无菌技术
对象：耐高温，需保持干燥的物品（玻璃器皿、金属器具）
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等。
干热灭菌箱
(2)干热灭菌法：160～170 ℃下加热2～3h
热空气为介质，
160~170℃，2~3h
注意
1、如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，可采用112℃ 500g/cm2压力 30min。
2、有些不能加热灭菌的化合物，如尿素（加热会分解）等，只能用G6玻璃砂漏斗过滤，但玻璃砂漏斗使用前也要在121℃下用纸包好灭菌。
玻璃砂漏斗有6种，即G1~G6，G6孔径最小，细菌不能过滤。
二、 无菌技术
过滤灭菌
高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
接种环
试管口
二、 无菌技术
用前将涂布器浸在盛有75%酒精的烧杯中。
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
用涂布器将菌液均匀地涂布在选择培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
玻璃刮刀（涂布器）使用前保存在75 %的酒精中，使用时放在酒精灯火焰上（除去残留酒精），直到熄灭，冷却后使用。
用后高压蒸汽灭菌保存
旁栏思考
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
2.请你判断以下材料或用具是否都需要灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿
（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管
（3） 实验操作者的双手
答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
无菌技术
煮沸消毒
（100℃，5～6min）常用
巴氏消毒
不破坏营养成分
化学药物消毒
可擦拭的表面、液体
紫外线消毒
空间消毒
消毒
较为温和理化生方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
2.消毒
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药物消毒法
紫外线照射消毒法
100 ℃煮沸5～6min
日常生活
62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s～1min
不耐高温的液体
用酒精擦拭双手、
用氯气消毒水源
生物活体、水源等
紫外线照射30min
接种室、接种箱，
超净工作台。
二、灭菌和无菌操作技术可以排除非目标微生物的干扰
将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上
打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30min
二、 无菌技术
场所
操作过程
制备马铃薯蔗糖培养基
三、配置可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基
1. 计算
2.配置20％马铃薯浸汁液
三、配置可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基
培养基：高压蒸汽灭菌；（装入锥形瓶，加棉塞，包牛皮纸扎紧）
防止污染和挥发
灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，也起到隔绝空气中杂菌的作用
三、配置可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基
3、制备斜面、平板、液体培养基
（一）液体培养基
三、配置可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基
（二）固体培养基（平板）
1、加入琼脂，加热融化
2、高压蒸汽灭菌
3、倒平板
三、配置可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基
（三）斜面
三、配置可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基
1、加入琼脂，加热融化
2、分装
3、高压蒸汽灭菌
4、摆斜面
橡胶塞
牛皮纸
玻璃漏斗
注意事项
①制作斜面培养基和固体培养基时要注意控制好温度，防止培养基提前凝固。
②斜面培养基试管中的液体量约为试管长度1/4(5-8mL)
③培养基需要经高压蒸汽灭菌(1kg/cm2、121℃下灭菌20min)
④棉塞的长度要保证既能塞住瓶口，在瓶口外又要留有一定的长度，方便接种时用无名指、小拇指取下来；粗细也要适当，以不易脱落为度。
⑤制作棉塞应该使用普通棉花，不能使用医用的脱脂棉，防止脱脂棉吸水后引起污染.
讨论
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
答：用手触摸锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：防止皿盖上的水珠落入培养基，影响微生物的生长。
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：最好不要用。因为空气中的微生物可能在此滋生。
无菌检测：
37℃倒置培养24～48h，观察是否有微生物生长。无杂菌污染才可用来接种大肠杆菌 。
如何判断培养基是否存在杂菌污染（操作过程是否规范）？
无菌技术要点
2.实验器具用什么方法灭菌？
1.培养基的配置过程
调pH值
混合加热融化（琼脂）
确定配方
及用量
灭菌
请回答下列问题：
培养基用什么方法灭菌？
高压蒸汽灭菌法或G6玻璃砂漏斗过滤法
含葡萄糖的培养基也可采用适当降低温度、压力（ 500g/cm2、112℃ ）以及延长时间（30min）的高压灭菌。（防止其碳化）
加热会分解的物质如尿素--G6玻璃砂漏斗过滤法
高压蒸汽灭菌法
培养皿、三角瓶、试管、移液管等常用高压蒸汽法灭菌，且灭菌后的仪器要放在烘箱烘干，使用时取出放在超净工作台中，然后打开紫外灯和过滤风，灭菌30min.
接种环常用灼烧灭菌，（接种环的环部、金属丝、金属丝与柄的连接部、连接部的上端）冷却后使用。
玻璃刮刀（涂布器）使用前保存在75 %的酒精中，使用时放在酒精灯火焰上（除去残留酒精），直到熄灭，冷却后使用。
分装
G6玻璃砂漏斗孔径最小，细菌不能滤过，使用前也要在121℃下用纸包好灭菌，使用后需用1mol/L的HCI浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至中性，干燥后保存。
3.双手用什么方法消毒？
4.为保证无杂菌，实验操作（接种和培养基的转移）都在哪里进行？
5.如何制备无菌水？
超净工作台的酒精灯火焰外焰旁
用三角瓶装水，高压蒸汽灭菌法灭菌
75%酒精擦拭
6.培养基分装时，不能将培养基黏附在三角瓶口、试管口、培养皿内壁上，容器口或壁，否则会发生污染。因此转移培养基到三角瓶口、试管口时应用三角漏斗操作。
7.操作完成后，仪器要高压灭菌后再保存，使用过的培养基要高压灭菌后再倒掉。 （ 1Kg/cm2、121℃ ）
8.试管或三角瓶口：棉塞不能用脱脂棉，以免吸水引起污染。棉塞应该使用普通棉花。

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