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5.2.3 酶分子修饰
通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰(Modification of Enzyme Molecule)。
酶分子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子。酶分子的结构决定了酶的性质和功能。当酶分子的结构发生改变时,将会引起酶的性质和功能的改变。
正是酶分子的完整空间结构赋予酶分子以生物催化功能。使酶具有催化效率高、专一性强和作用条件温和的特点。但是在另一方面,也是酶的分子结构使酶具有稳定性较差、活性不够高和可能具有抗原性等弱点,使酶的应用受到限制。为了克服酶的弱点,人们进行了酶分子修饰方面的研究。
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通过酶分子修饰,可以使酶分子结构发生某些改变,就有可能提高酶的活力,增强酶的稳定性,降低或消除酶的抗原性等。同时通过酶分子修饰,研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响,可以进一步探讨其结构与功能之间的关系,所以,酶分子修饰在酶学和酶工程研究方面具有重要的意义。
尤其是20世纪80年代以来,已将酶分子修饰与基因工程技术结合在一起,通过基因定位突变和聚合酶链反应( PCR)技术,改变DNA中的碱基序列,使酶分子的组成和结构发生改变,从而获得具有新的特性和功能的酶分子。由于酶分子修饰的信息储存在DNA分子中,通过基因克隆和表达,就可通过生物合成不断获得具有新的特性和功能的酶,使酶分子修饰展现出更加广阔的前景。
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酶分子修饰技术
1.金属离子置换修饰
把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰（Metal ion exchange modification）。
通过金属离子置换修饰,可以了解各种金属离子在酶催化过程中的作用。有利于阐明酶的催化作用机制。并有可能提高酶活力,增强酶的稳定性,甚至改变酶的某些动力学性质。
通过金属离子置换修饰可以达到下列目的：
1）阐明金属离子对酶催化作用的影响
2）提高酶活力
3）增强酶的稳定性
4）改变酶的动力学特性。
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2.大分子结合修饰
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合,使酶分子的空间构象发生改变,从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰(Macromolecular binding modification)。
大分子结合修饰是目前应用最广泛的酶分子修饰方法。其修饰的主要过程包括如下步骤：
1）修饰剂的选择
2）修饰剂的活化
3）修饰
4) 分离
通过大分子结合修饰,酶分子的结构发生某些改变,酶的特性和功能也将有所改变，可以提高酶活力,增加酶的稳定性,降低或消除酶的抗原性等。
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3.酶分子的侧链基团修饰
采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的侧链基团发生改变,从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰（Side chain modification）。
通过酶分子侧链基团修饰,达到以下目的：
1)可以研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响,并可以用于研究酶的活性中心中的必需基团；
2)可以测定某一种基团在酶分子中的数量；
3)在酶工程方面可以提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性,并且可能引起酶催化特性和催化功能的改变,以提高酶的使用价值；
4)还可能获得自然界原来不存在的新酶种。
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酶有蛋白类酶和核酸类酶两大类别, 它们的侧链基团不同, 修饰方法也有所区别:
(1)蛋白类酶主要由蛋白质组成 ,酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。这些基团可以形成各种副键,对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变,从而改变酶的特性和功能。
酶蛋白侧链基团修饰可以采用各种小分子修饰剂,例如, 氨基修饰剂、羧基修饰剂、巯基修饰剂、胍基修饰剂、酚基修饰剂、咪唑基修饰剂、吲哚基修饰剂等;也可以采用具有双功能团的化合物,如戊二醛、己二胺等进行分子内交联修饰;还可以采用各种大分子与酶分子的侧链基团形成共价键而进行大分子结合修饰。
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(2)酸类酶主要由核糖核酸(RNA)组成 ,酶RNA的侧链基团是指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。RNA分子上的侧链基团主要包括磷酸基,核糖上的羟基,嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基(酮基)等。
通过侧链基团修饰,有可能使核酸类酶的稳定性得以提高。如果对核酸类酶分子上某些核苷酸残基进行修饰,连接上氨基酸等有机化合物,就有可能扩展核酸类酶的结构多样性, 从而扩展其催化功能,提高酶的催化活力。
酶的侧链基团修饰方法很多,主要有氨基修饰(Amino-modified)、羧基修饰(Carboxyl modification)、巯基修饰(Mercapto modification)、胍基修饰(Guanidine modification)、酚基修饰（Phenolic modification）、咪唑基修饰(Imidazole modification)、吲哚基修饰(Indole modification)、分子内交联修饰(Intramolecular crosslinking modification)等。
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4.肽链有限水解修饰
蛋白类酶(P酶)的组成单位是氨基酸。氨基酸通过肽键连接成肽链,再通过盘绕折叠形成完整的空间结构。肽链是蛋白类酶(P酶)的主链。主链是酶分子结构的基础,蛋白类酶活性中心的肽段对酶的催化作用是必不可少的,活性中心以外的肽段起到维持酶的空间构象的作用。肽链一旦改变, 酶的结构和特性将随之有某些改变。
酶蛋白的肽链被水解以后,可能出现下列3种情况:a)若肽链的水解引起酶活性中心的破坏,酶将丧失其催化功能,这种修饰主要用于探测酶活性中心的位置;b)若肽链的一部分被水解后,仍然可以维持酶活性中心的空间构象,则酶的催化功能可以保持不变或损失不多,但是其抗原性等特性将发生改变,这将提高某些酶特别是药用酶的使用价值;c)若主链的断裂有利于酶活性中心的形成,则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。
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在肽链的限定位点进行水解,使酶的空间结构发生某些精细的改变,从而改变酶的特性和功能的方法,称为肽链有限水修饰(Modification of peptide chain with limited hydrolysis)。
有些酶的活性较低,通过酶分子主链修饰可以显著提高酶的催化活性。例如,天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰,从其羧基端切除10个氨基酸残基的肽段,可以使天冬氨酸酶的活力提高5 倍左右。
酶蛋白的肽链有限水解修饰通常使用某些专一性较高的蛋白酶或肽酶作为修饰剂。有时也可以采用其他方法使酶的主链部分水解,而达到修饰目的。
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5.核苷酸链剪切修饰
核酸类酶(R酶)主要由核苷酸组成,核苷酸通过磷酸二酯键连结成为核苷酸链。核苷酸链一旦改变,核酸类酶的结构和功能将发生改变。
在核苷酸链的限定位点进行剪切,使酶的结构发生改变,从而改变酶的特性和功能的方法,称为核苷酸链剪切修饰(Nucleotide modification of nucleotide chain)。
某些RNA分子原本不具有催化活性,经过适当的修饰作用,在适当位置去除一部分核苷酸残基以后,可以显示酶的催化活性,成为一种核酸类酶。
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6.氨基酸置换修饰
将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法,称为氨基酸置换修饰(Amino acid replacement)。氨基酸置换修饰的主要作用有提高酶活力，增强酶的稳定性，使酶的专一性发生改变。
氨基酸置换修饰的主要方法有：
1)化学修饰法
2)定点突变(Site directedm utagenesis)
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7.核苷酸置换修饰
核酸类酶的基本组成单位是核苷酸。在特定位置上的核苷酸是核酸类酶的化学结构和空间结构的基础。核苷酸链上某个核苷酸的改变将会引起酶的化学结构和空间构象的改变,从而改变酶的某些特性和功能。
将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法,称为核苷酸置换修饰（Nucleotide permutation modification）。
核苷酸置换修饰通常采用定位突变技术进行。只要将核苷酸链中的一个或几个核苷酸置换,就可以使核酸类酶的特性和功能发生改变。
采用核苷酸置换修饰技术,可将保守核苷酸以外的某个或某些核苷酸置换,以获得各种不同的人造核酸类酶。
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8.酶分子的物理修饰
通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰(Physical modification)。
通过酶分子的物理修饰,可以了解在不同物理条件下,特别是在高温、高压、高盐、低温、真空、失重、极端pH值、有毒环境等极端条件下,由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。极端条件下酶催化特性的研究对于探索太空、深海、地壳深处以及其他极端环境中,生物的生存可能性及其潜力有重要的意义,同时还有可能获得在通常条件下无法得到的各种酶的催化产物。
通过酶分子的物理修饰,还可能提高酶的催化活性,增强酶的稳定性或者是酶的催化动力学特性发生某些改变。
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酶分子物理修饰的特点在于不改变酶的组成单位及其基团,酶分子中的共价键不发生改变。只是在物理因素的作用下,副键发生某些变化和重排,使酶分子的空间构象发生某些改变。例如,羧肽酶γ经过高压处理,底物特异性发生改变,其水解能力降低,而有利于催化多肽合成反应;用高压方法处理纤维素酶,该酶的最适温度有所降低,在30～40℃的条件下,高压修饰的纤维素酶比天然酶的活力提高10% 。
酶分子的空间构象的改变还可以在某些变性剂的作用下,首先使酶分子原有的空间构象破坏,然后在不同的物理条件下,使酶分子重新构建新的空间构象。
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