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5. 现代环境生物技术原理
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5.1 概述
现代生物技术定义
1986年国家科委制订《中国生物技术政策纲要》时，将生物技术定义为：以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。
先进的工程技术手段是指基因工程、酶工程、细胞工程和发酵工程等新技术。
改造生物体是指获得优良品质的动物、植物或微生物品系。
生物原料则是指生物体的某一部分或生物生长过程中所能利用的物质，如淀粉、糖蜜、纤维素等有机物，也包括一些无机化合物，甚至某些矿石。
为人类生产出所需的产品包括粮食、医药、食品、化工原料、能源、金属等各种产品。
目的则包括疾病的预防、诊断与治疗，环境污染的检测与治理等。
第5章现代环境生物技术原理
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2. 现代生物技术的内容
现代生物技术主要包括：基因工程、酶工程、细胞工程和发酵工程。这些技术并不是各自独立的，而是相互联系、相互渗透的（图5-1）。其中基因工程技术是核心技术，它能带动其他技术的发展，如通过基因工程对细菌或细胞改造后获得的工程菌或细胞，必须通过发酵工程或细胞工程来生产有用物质。
第5章现代环境生物技术原理
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3. 现代生物技术的应用
生物技术已广泛应用于农业、医药、化工、食品、环境保护等众多领域。生物技术的应用过程示意图如图5-2所示。
第5章现代环境生物技术原理
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4. 现代环境生物技术的发展
传统的生物技术(Conventional biologic technology)可以追溯到遥远的古代。
人类有意识地利用酵母进行大规模发酵生产是在19世纪。
20世纪上半叶,人类已能脱离生物的自然繁殖过程,利用直接的方法改变生物的遗传物质。
匈牙利的Karl Ereky于1917提出“生物技术”一词 。他当时是指用甜菜作为饲料进行大规模养猪,即利用生物将原材料转变为产品。
1953年, 美国生物学家沃森(J .D .Watson) 和英国物理学家克里克( F.H.C.Crick)提出了DNA双螺旋结构分子模型,标志着现代分子生物学的诞生,揭示了世界上千差万别的生命物种个体在分子结构和遗传机制上的统一性,并为后来以 DNA重组(DNA recombination)为主要手段的基因工程奠定了基础。
1973年,美国加利福尼亚大学旧金山分校的Herber Boyer教授和斯坦福大学的Stanley Cohen教授合作进行了人类历史上第一次有目的基因重组(Genetic recombination)实验。
1975年,Kohler和Milstein创立了淋巴细胞杂交瘤技术(Lymphocyte hybridoma technology),获得了单克隆抗体(Monoclonal antibody)。
现代生物技术是以DNA 重组技术的建立为标志的,已成为一门多学科纵横交叉的新兴和综合性技术。
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第5章现代环境生物技术原理
5. 现代环境生物技术
（1）环境生物技术的产生
由于人口的快速增长，自然资源的大量消耗，全球环境状况目前正在急剧恶化：水资源短缺、土壤荒漠化、有毒化学品污染、臭氧层破坏、酸雨肆虐、物种灭绝、森林减少等。人类的生存和发展面临着严峻的挑战，迫使人类进行一场“环境革命”来拯救人类自身。在这场环境革命中，环境生物技术担负着重大使命，并且作为一种行之有效、安全可靠的手段和方法，起着核心的作用。
现代环境生物技术是现代生物技术应用于环境污染防治的一门新兴边缘学科。它诞生 与20世纪80年代末期，以高新技术为主体，并包括对传统生物技术的强化与创新。环境生物技术涉及众多的学科领域，主要由生物技术、工程学、环境学和生态学等组成。它是由生物技术与环境污染防治工程及其他工程技术紧密结合形成的，既具有较强的基础理论，又具有鲜明的技术应用特点。
第5章现代环境生物技术原理
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包括以下三方面：
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在环境中应用的生物技术，这是相对于一些在高度控制条件下的密闭反应器中进行的生物技术而言；
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涉及到环境中某些可以看作为一个生物反应器部分的生物技术 .
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作用于一些必定要进入环境的材料的生物技术 .
第5章现代环境生物技术原理
广义上讲，凡是自然界中涉及环境污染控制的一切与生物技术有关的技术，都可称为环境生物技术。
德国国家生物技术研究中心的K.Timmis博士将环境生物技术定义为应用生物圈的某些部分使环境得以控制，或治理预定要进入生物圈的污染物的生物技术。
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美国密歇根州立大学的J.M.Tiedje教授认为，环境生物技术的核心是微生物学过程。
近年来，环境生物技术发展极其迅猛，已成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决复杂环境问题的最有效手段。
国际上认为21世纪生物技术产业化的十大热点中，环境污染监测、有毒污染物的生物降解和生物降解塑料三项属于环境生物技术的内容。
严格地说，环境生物技术指的是直接或间接利用生物或生物体的某些组成部分或某些机能，建立降低或消除污染物产生的生产工艺，或者能够高效净化环境污染，同时又生产有用物质的工程技术。
环境生物技术作为生物技术的一个分支学科，它除了包括生物技术所有的基础和特色之外，还必须与污染防治工程及其他工程技术相结合。
第5章现代环境生物技术原理
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环境生物技术可分为高、中、低三个层次。
高层次是指以基因工程为主导的现代污染防治生物技术，如基因工程菌的构建、抗污染型转基因植物的培育等；
中层次是指传统的生物处理技术，如活性污泥法、生物膜法，及其在新的理论和技术背景下产生的强化处理技术和工艺，如生物流化床、生物强化工艺等；
低层次是指利用天然处理系统进行废物处理的技术，如氧化塘、人工湿地系统等。
第5章现代环境生物技术原理
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环境生物技术的三个层次均是污染治理不可缺少的生物技术手段。高层次的环境生物技术需要以现代生物技术知识为背景，为寻求快速有效的污染治理与预防新途径提供了可能，是解决目前出现的日益严重且复杂的环境问题的强有力手段。中层次的环境生物技术是当今废物生物处理中应用最广泛的技术，中层次的技术本身也在不断改进，高技术也不断渗入，因此，它仍然是目前环境污染治理中的主力军。低层次的环境生物技术，其最大特点是充分发挥自然界生物净化环境的功能，投资运行费用低，易于管理，是一种省力、省费用、省能耗的技术。
各种工艺与技术之间可能存在相互渗透或交叉应用的现象，有时难以确定明显的界限。
某项环境生物技术可能集高、中、底三个层次的技术于一身。
为了解决日益严重的环境污染问题，需配合使用高、中、低三个层次的技术，针对不同的问题，采用不同的技术或不同技术的组合。
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（2）环境生物技术的研究范围
现代环境生物技术应用现代生物技术服务于环境保护，目前环境生物技术面临的任务有：
1）解决基因工程菌从实验室进入模拟系统和现场应用过程中，其遗传稳定性、功能高效性和生态安全性等方面的问题；
2）开发废物资源化和能源化技术，利用废物生产单细胞蛋白、生物塑料、生物肥料以及利用废物生产生物能源，如甲烷、氢气、乙醇等；
3）建立无害化生物技术清洁生产新工艺，如生物制浆、生物絮凝剂、煤的生物脱硫、生物冶金等；
4）发展对环境污染物的生理毒性及其对生态影响的检测技术。
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现代生物技术的发展，给环境生物技术的纵深发展增添了强大的动力，生物技术无论是在生态环境保护方面，还是在污染预防和治理方面以及环境监测方面，都显示出独特的功能和优越性。
环境生物技术也面临许多难题，而这些难题的解决，依赖于现代生物技术的发展去开辟道路。人们有理由、有信心相信，最终环境问题解决的希望寄托在现代环境生物技术的进展和突破上。
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5.2酶工程基本原理
酶工程(Enzyme engineering)是研究酶的生产和应用的一门新的技术性学科，是利用酶的催化作用进行物质转化（合成有用物、分解有害物）的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术。
酶工程的内容包括：酶的生产与分离纯化、酶分子修饰、酶固定化、酶反应动力学与反应器和酶的应用等方面。
酶工程的主要任务是：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能，即利用酶的特定功能，借助工程学手段为我们提供产品或分解有害物质。
酶工程的目的是：为我们提供产品或以特定的功能来为我们服务。
酶可以高效、专一地催化特定的化学反应, 并具有反应条件温和、反应产物容易纯化等 优点。酶促反应耗能低,污染小,操作简单,易控制。因此, 它与传统的化学反应相比,具有较强的竞争力。
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5.2.1酶的生产
酶的生产是指经过预先设计，通过人工操作控制而获得所需酶的技术过程。酶作为生物催化剂( Biocatalyst)普遍存在于动物、植物和微生物中。广义上讲,一切生物体都可以作为酶的来源。在实际中，对酶源的要求是酶含量丰富，提取与纯化方便。
酶的早期来源为动物脏器和植物种子，现在主要以微生物( Microorganism)作为酶源。
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微生物作为酶源具有以下优越性:
1)易得到所需的酶类
2）易获得高产菌株
3）微生物生长周期短
4）生产成本低
5）生产易管理
6）提高微生物产酶能力的途径较多
7）通过微生物培养条件的研究，可大幅度提高酶产量或定向改造酶 (如高温淀粉酶 )， 甚至得到诱导酶(Lnduced enzyme)。
由于以上优点,目前工业上应用的酶,绝大多数来自微生物,且这种趋势有增无减。
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5.2.2酶的提取与分离纯化
酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来,再与杂质分开,而获得所要求的酶制品的过程。主要内容包括细胞破碎,酶的提取,离心分离,过滤与膜分离,沉淀分离,层析分离,电泳分离,萃取分离,浓缩,干燥、结晶等。
1.细胞破碎
酶的种类繁多,存在于不同生物体的不同部位。除了动物和植物体液中的酶和微生物胞外酶之外,大多数酶都存在于细胞内部。为了获得细胞内的酶,首先要收集组织、细胞并进行细胞或组织破碎,使细胞的外层结构破坏,然后进行酶的提取和分离纯化。
对于不同的生物体,或同一生物体的不同组织的细胞,由于其外层结构不同,所采用的细胞破碎(Cell disruption)方法和条件亦有所不同。必须根据具体情况进行适当的选择,以达到预期的效果。
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细胞破碎方法可以分为机械破碎法（Machine crushing process）、物理破碎法（Physical crushing process）、化学破碎法（Chemical crushing process）和酶促破碎法（Enzyme–induced crushing process ）等(表5-1)。在实际使用时应当根据具体情况选用适宜的细胞破碎方法,有时也可以采用2种或2种以上的方法联合使用,以便达到细胞破碎的效果,又不会影响酶的活性。
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2.酶的提取
酶的提取( Extraction of enzyme )是指在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程,也称为酶的抽提。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。一般说来,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中,酸性物质易溶于碱性溶剂中,碱性物质易溶于酸性溶剂中。
酶都能溶解于水,通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取,有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则可用有机溶剂提取。酶提取的主要方法如表5-2所示。
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酶提取的影响因素
1）温度：一般适当提高温度,可以提高酶的溶解度,也可以增大酶分子的扩散速度,但是温度过高,则容易引起酶的变性失活,所以提取时温度不宜过高。
2）pH值：在等电点(Isoelectric point，pI)的条件下,酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度,提取时pH值应该避开酶的等电点,以提高酶的溶解度。但是溶液的pH值不宜过高或过低,以免引起酶的变性失活。
3）提取液的体积：增加提取液的用量,可以提高酶的提取率。但是过量的提取液,会使酶的浓度降低,对进一步的分离纯化不利。
在提取过程中,为了提高酶的稳定性,免致引起酶的变性失活,可适当加入某些保护剂, 如酶作用的底物、辅酶、某些抗氧化剂等。
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3.沉淀分离
沉淀分离 (Precipitation separation)是通过改变某些条件或添加某种物质,使酶的溶解度降低,从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程。
沉淀分离的方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等(表5-3)。
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(1)盐析沉淀法
盐析沉淀法(Salting - out precipitation)简称盐析法,是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性,通过在酶液中添加一定浓度的中性盐,使酶或杂质从溶液中析出沉淀,从而使酶与杂质分离的过程。
蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下,蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加,这种现象称为盐溶(Salting in)。而在盐浓度升高到一定程度后, 蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低,结果使蛋白质沉淀析出, 这种现象称为盐析( Salting out)。在某一浓度的盐溶液中,不同蛋白质的溶解度各不相同,由此可达到彼此分离的目的。
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盐之所以会改变蛋白质的溶解度,是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反离子作用,使蛋白质分子表面的电荷改变,同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度,使分子表面的水化膜改变。可见酶在溶液中的溶解度与溶液的离子强度关系密切。它们之间的关系可用下式表示:
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Ks的大小与离子价数成正比、与离子半径和溶液的介电常数成反比,也与酶或蛋白质的结构有关。不同的盐对某种蛋白质具有不同的盐析系数。同一种盐对于不同的蛋白质也有不同的盐析系数。
对于某一种具体的酶或蛋白质,在温度和pH值等盐析条件确定(即β确定),所使用的盐确定(即Ks确定)之后,酶或蛋白质在盐溶液中的溶解度决定于溶液中的离子强度I。
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离子强度I是指溶液中离子强弱的程度,与离子浓度和离子价数有关。即:
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在蛋白质的盐析中,通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等,其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小(如在25℃时,其溶解度为767g/L；在0℃时,其溶解度为697g/ L)不影响酶的活性,分离效果好,而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时,缓冲能力较差,而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定, 所以有时也用其他中性盐进行盐析。
在盐析时,溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。饱和度（Saturability）是指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。例如,70ml酶液加入30 ml饱和硫酸铵溶液, 则混合溶液中硫酸铵的饱和度为30/(30+70)=0.3。
由于不同的酶有不同的结构,盐析时所需的盐浓度各不相同。此外,酶的来源、酶的浓度、杂质的成分等对盐析时所需的盐浓度亦有所影响。在实际应用时,可以根据具体情况,通过试验确定。
盐析时,温度一般维持在室温左右,对于温度敏感的酶,则应在低温条件下进行。溶液的pH值应调节到欲分离的酶的等电点附近。
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(2)等电点沉淀法
利用两性电解质（Amphoteric electrolyte）在等电点(pI)时溶解度最低,以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性, 通过调节溶液的pH值,使酶或杂质沉淀析出,从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀法(Isoelectric precipitation)。
在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时,该两性电解质分子的净电荷为零, 分子间的静电斥力消除,使分子能聚集在一起而沉淀下来。
由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在,使酶等大分子物质仍有一定的溶解性,而使沉淀不完全。所以在实际使用时,等电点沉淀法往往与其他方法一起使用。例如,等电点沉淀法经常与盐析沉淀、有机溶剂沉淀和复合沉淀等一起使用。有时单独使用等电点沉淀法,主要是用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。
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(3)有机溶剂沉淀法
利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同,通过添加一定量的某种有机溶剂,使酶或杂质沉淀析出,从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法（Organic solvent precipitation）。有机溶剂之所以能使酶沉淀析出，主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数( Dielectric constant)降低。溶液的介电常数降低,就使溶质分子间的静电引力增大,互相吸引而易于凝集,同时,对于具有水膜的分子来说,有机溶剂与水互相作用,使溶质分子表面的水膜破坏,也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍左右,不同的酶和使用不同的有机溶剂时,有机溶剂的使用浓度有所不同。
有机溶剂沉淀法的分离效果受到溶液pH值的影响,一般应将酶液的pH值调节到欲分离酶的等电点附近。
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(4)复合沉淀法
在酶液中加入某些物质,使其与酶形成复合物而沉淀下来,从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法（Composite precipitation）。分离出复合沉淀后,有的可以直接应用,也可以再用适当的方法,使酶从复合物中析出而进一步纯化。常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。
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(5)选择性变性沉淀法
选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀,而不影响所需的酶,这种分离方法称为选择性变性沉淀法（Selective denaturing precipitation）。例如,对于热稳定性好的酶, 如α-淀粉酶等,可以通过加热进行热处理,使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。此外,还可以根据酶和所含杂质的特性,通过改变pH值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。
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4.离心分离
离心分离（Centrifugal separation）是借助于离心机旋转所产生的离心力,使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时,要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同,选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
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5.过滤与膜分离
过滤（Filtration）是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样,常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等,可以根据需要选用。
根据过滤介质的不同, 过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类。其中粗滤和部分微滤采用高分子膜以外的物质作为过滤介质,称为非膜过滤;而大部分微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用各种高分子膜为过滤介质,称为膜过滤,又称为膜分离技术（Membrane separation technology）。
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根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同,过滤可以分为粗滤（Primary filter）、微滤（Microfiltration）、超滤（Ultrafiltration）和反渗透（Reverse osmosis）等4大类。它们的主要特性如表5-4所示。
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6.层析分离
层析分离（Chromatographic separation）是利用混合液中各组分的物理化学性质(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同,使各组分以不同比例分布在两相中。其中一个相是固定的称为固定相,另一个相是流动的,称为流动相。当流动相流经固定相时,各组分以不同的速度移动,从而使不同的组分分离纯化。
酶可以采用不同的层析方法进行分离纯化, 常用的有吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等(表5-5)。
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(1)吸附层析
吸附层析（Adsorption chromatography）是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。
任何两个相之间都可以形成一个界面,其中一个相中的物质在两相界面上的密集现象称为吸附（Adsorption）。
凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂(Adsorbent)。吸附剂一般是固体或者液体, 在吸附层析中通常应用的是固体吸附剂。
能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。吸附剂与被吸附物之间的相互作用力主要是范德华力。其特点是可逆的。即在一定条件下,被吸附物被吸附到吸附剂的表面上;而在另外的某种条件下,被吸附物可以离开吸附剂表面,称之为解吸作用(Desorption)。
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吸附层析通常采用柱型装置,将吸附剂装在吸附柱中,装置成吸附层析柱。
用适当的溶剂或者溶液从吸附柱中把被吸附组分洗脱出来的方法主要有3种。
1)溶剂洗脱法。溶剂洗脱法(Solvent elution)是采用单一或者混合的溶剂进行洗脱的方法,是目前应用最广泛的方法。
操作时,在加入欲分离混合溶液以后,连续不断地加入溶剂进行冲洗,最初的流出液为溶剂本身,接着洗脱出来的是吸附力最弱的组分,随后混合溶液中的各组分按照吸附力由弱到强的顺序先后洗出, 吸附力最强的组分最后洗脱出来。把各组分分别收集,就可达到分离的目的。用洗脱液体积对各组分浓度作图,可以得到洗脱曲线(图5-3)。
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2)置换洗脱法。置换洗脱法(Displacement elution)又称为置换法或取代法。所用的洗脱剂是置换洗脱液。置换洗脱溶液中含有一种吸附力比被吸附组分更强的被称为置换剂的物质。当用置换洗脱液冲洗层析柱时,置换剂取代了原来被吸附组分的位置,使被吸附组分不断向下移动。经过一定时间之后, 样品中的各组分按照吸附力从弱到强的顺序先后流出,最后流出的是置换洗脱液本身。以洗脱液体积对组分浓度作图,可以得到阶梯式的洗脱曲线(图5-4)。
从图5-4中可以看到,置换洗脱法可使各个组分分离,图中每一个阶梯只有一种组分,并可以求出各组分的浓度。然而由于各组分一个接一个,界限不分明,交界处互相混杂,分离效果并不理想。
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3)前缘洗脱法（又称前缘分析法）。前缘洗脱法是连续向吸附层析柱内加入欲分离的混合溶液,即所用的洗脱液为含有各组分的混合溶液本身。在洗脱过程中,最初流出液为混合液中的溶剂,不含欲分离的组分,当加入一定体积的混合溶液后,吸附柱内的吸附剂已经达到饱和状态,吸附力最弱的组分开始流出,其浓度比混合液中该组分的浓度高。随后,混合液中的各组分按照吸附力由弱到强的顺序,先后以两组分、三组分 多组分的混合液流出,最后的流出液与欲分离混合液的组分完全相同。其洗脱曲线如图5-5所示。
从图5-5中可以看到,前缘洗脱法的洗脱曲线也呈阶梯形。最初的流出液为纯溶剂,组分浓度为0; 接着流出的第一个阶梯洗脱液中,含有吸附力最弱的组分A;第二阶梯洗脱液中,含有组分A和B;第三阶梯洗脱液中,含有A、B、C 3种组分 ; 最后一个阶梯洗脱液中,含有混合液中的所有组分。
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前缘洗脱法实际上只有在洗脱过程中走在最前缘的组分,即吸附力最弱的A组分,得以和其他组分分离。此法不是理想的分离方法,仅作为前缘组分的分析研究之用,所以又称为前缘分析法。
在吸附层析过程中,要取得良好的分离效果,首先要选择好适当的吸附剂和洗脱剂,否则难以达到分离目的。
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(2)分配层析
分配层析（Partition chromatography）是利用各组分在两相中的分配系数不同,而使各组分分离的方法。分配系数(Partition coefficient)是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时,该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后,层析系数是一常数,以K表示。
在分配层析中,通常采用一种多孔性固体支持物(如滤纸、硅藻土、纤维素等) 吸着一种溶剂为固定相,这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动, 称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时, 该溶质在两相之间进行连续的动态分配。其分配系数为:
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分配系数与溶剂和溶质的性质有关,同时受温度、压力等条件的影响。所以,不同的物质、在不同的条件下,其分配系数各不相同。在层析条件确定后,某溶质在确定的层析系统中的分配系数是一常数。由于不同的溶质有不同的分配系数,移动速度不同,从而达到分离。
分配层析主要有纸上层析（Paper chromatography）、薄层层析（Thin layer chromatography）、气相层析（Gas phase chromatography）等方法。
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（3）离子交换层析
离子交换层析（Ion exchange chromatography）是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质,通过在不溶性高分子物质(母体) 上引入若干可解离基团(活性基团)而制成。
按活性基团的性质不同,离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质,所以可用阳离子交换剂,也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。在溶液的pH值大于酶的等电点时,酶分子带负电荷,可用阴离子交换剂进行层析分离;而当溶液pH值小于酶的等电点时,酶分子带正电荷,则要采用阳离子交换剂进行分离。按母体物质种类的不同,离子交换剂有离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。其中某些大孔径的离子交换树脂,离子交换纤维素和离子交换凝胶可用于酶的分离纯化。
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在一定条件下,某种组分离子在离子交换剂上的浓度与在溶液中的浓度达到平衡时,两者浓度的比值K称为平衡常数(也叫分配系数)。即:
平衡常数(Equilibrium constant)K是离子交换剂上的活性基团与组分离子之间亲和力大小的指标。平衡常数K 的值越大, 离子交换剂上的活性基团对某组分离子的亲和力就越大。表明该组分离子越容易被离子交换剂交换吸附。
K值的大小决定组分离子在离子交换柱内的保留时间。K值越大,保留时间就越长。如果欲分离的溶液中各种组分离子的K值有较大的差别,通过离子交换层析就可以使这些组分离子得以分离。
不同的离子对离子交换剂的亲和力各不相同。通常两者的亲和力随离子价数和原子序数的增加而增大,而随离子表面水化膜半径的增加而降低。
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(4)凝胶层析
凝胶层析(Gel chromatography)又称为凝胶过滤,分子排阻层析,分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相,利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。
凝胶层析柱中装有多孔凝胶,当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时,各组分在层析柱内同时进行两种不同的运动。一种是随着溶液流动而进行的垂直向下的移动,另一种是无定向的分子扩散运动(布朗运动)。大分子物质由于分子直径大,不能进入凝胶的微孔,只能分布于凝胶颗粒的间隙中,以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内,不断地进出于一个个颗粒的微孔内外,这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢,从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱,而达到分离的目的。在凝胶层析中,分子质量也并不是唯一的分离依据,有些物质的分子质量相同,但由于分子的形状不同,再加上各种物质与凝胶之间存在着非特异性的吸附作用,故仍然可以分离。
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为了定量地衡量混合液中各组分的流出顺序,常常采用分配系数Ka来量度:
如果某组分的分配系数Ka=0,即Ve=Vo,说明该组分完全不能进入凝胶微孔,洗脱时最先流出;如果某组分的分配系数Ka=1,即Ve=Vo+VI,说明该组分可以自由地扩散进入到凝胶颗粒内部的所有微孔,洗脱是最后流出;如果某组分的分配系数Ka在0～1,说明该组分分子大小介乎大分子和小分子之间,可以进入凝胶的微孔,但是扩散速度较慢,洗脱时按照Ka值由小到大的顺序先后流出。
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关于大分子和小分子在凝胶内的流动速度的差异,有多种理论进行解释,如流动分离理论、扩散分离理论等。
流动分离理论认为,当大小不同的溶质分子在毛细管中流动时,由于大分子的颗粒直径与毛细管的内径属同一个数量级,所以在毛细管中流动时,集中于毛细管的中心区域。在中心区域,流体流动的速度较快,因而大分子溶质很快就被溶剂分子带走;而小分子溶质,不仅在中心区域有所分布,在靠近毛细管管壁处也有大量分布,管壁处的溶剂以层流(滞流)流动,流速较慢,小分子被带出的速度就较慢。
扩散分离理论认为,大分子溶质扩散系数小,扩散到凝胶微孔中的程度小,较易被洗脱出来,小分子溶质的扩散速度大,很容易进入到凝胶微孔中,所以较难被洗出。
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在凝胶对组分没有吸附作用的情况下,当洗脱液的总体积等于外体积和内体积的总和时, 所有组分都应该被洗脱出来,即Ka的最大值为1。然而在某种情况下,会出现Ka大于1的现象, 这说明在此层析过程中,不是单纯的凝胶层析,而是同时存在吸附层析或离子交换层析等过程。
对于同一类型的化合物,凝胶层析的洗脱特性与组分的相对分子质量成函数关系,洗脱时组分按相对分子质量由大到小的顺序先后流出。组分的洗脱体积Ve与相对分子质量(M)的关系可以用下式表示:
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以组分的洗脱体积(Ve)对组分的相对分子质量的对数(lgM)做出曲线,可以通过测定某一组分的洗脱体积,从曲线中查出该组分的相对分子质量。
在实际应用中,常以相对洗脱体积Kav对lgM做曲线,称为选择曲线。相对洗脱体积是指组分洗脱体积与层析柱内凝胶床总体积之比值(Kav=Ve/Vt)。
选择曲线的斜率说明凝胶的特性。每一类型的化合物, 如酶、右旋糖酐、球蛋白等,都有其各自特定的选择曲线(图5-6)。所以通过凝胶层析可以测定物质的相对分子质量。
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凝胶材料主要有葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等。层析用的微孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成。交联剂加得越多, 载体颗粒的孔径就越小。所使用的交联剂有环氧氯丙烷等。凝胶的种类很多,其共同特点是凝胶内部具有微细的多孔网状结构,其孔径的大小决定其用于分离的组分颗粒的大小。
凝胶选择的主要依据是欲分离组分的分子质量的大小。凝胶颗粒直径的大小对层析柱内溶液的流速有一定影响。选择凝胶时注意颗粒大小应当比较均匀,否则流速不稳定,从而会影响分离效果。
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(5)亲和层析
亲和层析(Affinity chromatography)是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力,使生物分子分离纯化的技术。酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、酶RNA与互补的RNA分子或片段, RNA与互补的DNA分子或片段之间,都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用。
根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为共价亲和层析(Covalent affinity chromatography)、疏水层析(Hydrophobic chromatography)、金属离子亲和层析(Metalion affinity chromatography)、免疫亲和层析(Immuno affinity chromatography)、染料亲和层析(Dye affinity chromatography)、凝集素亲和层析(Lectin chromatography)等。
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(6)层析聚焦
层析聚焦(Chromatofocusing)是将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起,实现组分分离的技术。在层析系统中,柱内装上多缓冲离子交换剂,当加进两性电解质载体的多缓冲溶液流过层析柱时,在层析柱内形成稳定的pH梯度。欲分离酶液中的各个组分在此系统中会移动到(聚焦于)与其等电点相当的pH位置上,从而使不同等电点的组分得以分离。
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7.电泳分离
带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳(Electrophoresis)。电泳按其使用的支持体的不同,可以分为纸电泳(Paper electrophoresis)、薄层电泳(Thin-layer electrophoresis)、薄膜电泳(Thin-membrance electrophoresis)、凝胶电泳(Gel electrophoresis)、自由电泳和等电聚焦电泳(Isoelectric focusing electrophoresis)等。
不同的物质由于其带电性质及其颗粒大小和形状不同,在一定的电场中移动方向和移动速度也不同,故此可使它们分离。物质颗粒在电场中的移动方向,决定于它们所带电荷的种类。带正电荷的颗粒向电场的阴极移动;带负电荷的颗粒则向阳极移动。净电荷为0的颗粒在电场中不移动。颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量,同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外,还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。
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1）电场强度
电场强度(Electric field intensity)是指每厘米距离的电压降。又称为电位梯度或电势梯度。电场强度对颗粒的泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高,带电颗粒的泳动速度越快。根据电场强度的大小可将电泳分为高压电泳和常压电泳。常压电泳的电场强度一般为2～10V/cm,电压为100～500V,电泳时间从几十分钟到几十小时,多用于带电荷的大分子物质的分离;高压电泳的电场强度为20～200V/cm,电压大于500V,电泳时间从几分钟到几小时,多用于带电荷的小分子物质的分离。
2）溶液的pH值
溶液的pH值决定了溶液中颗粒分子的解离程度,也就是决定了颗粒分子所带净电荷的多少。对于两性电解质而言,溶液的pH值不仅决定颗粒分子所带电荷的种类, 而且决定净电荷的数量。溶液的pH值离开其等电点越远,颗粒所带净电荷越多,泳动速度越快。反之,颗粒的泳动速度则慢。当溶液的pH值等于某溶质的等电点时,其净电荷为0,泳动速度也等于0。因此,电泳时,溶液的pH值应该选择在适当的数值,并需采用缓冲液使pH值维持恒定。
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3）溶液的离子强度
溶液的离子强度(Ionic strength)越高,颗粒的泳动速度越慢。一般电泳溶液的离子强度为0.02～0.2较为适宜。
4）电渗
在电场中,溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗(Electric osmosis)。例如,在纸电泳中,由于滤纸纤维素上带有一定量的负电荷,使与滤纸相接触的水分子感应而带有一些正电荷,水分子便会向负极移动并带动溶液中的颗粒一起向负极移动,若颗粒本身向负极移动,则表观泳动速度将比其本来的泳动速度快;若颗粒本身原来向正极移动,则其表观泳动速度慢于其本来的泳动速度;净电荷为0的颗粒,也会随水向负极移动。
此外,缓冲液的黏度和温度等也对颗粒的泳动速度有一定的影响。
在酶学研究中,电泳技术主要用于酶的纯度鉴定、酶分子质量测定、酶等电点测定以及少量酶的分离纯化。
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8.萃取分离
萃取分离(Extraction separation)是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其他流体。按照两相的组成不同,萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取(Supercritical fluid extraction)和反胶束萃取(Eversed micelles extraction)等。
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9.结晶
结晶(Crystallization)是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品,而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。
酶在结晶时,酶液应达到一定的浓度。浓度过低无法析出结晶。一般说来,酶的浓度越高, 越容易结晶。但是浓度过高时,会形成许多小晶核,结晶小,不易长大。所以结晶时酶液浓度应当控制在介稳区,即酶浓度处于稍微过饱和的状态。
此外,在结晶过程中还要控制好温度、pH值、离子强度等结晶条件。才能得到结构完整, 大小均一的晶体。
常用的结晶方法有盐析结晶法(Salting-out crystallization)、有机溶剂结晶(Organic solvent crystallization)、透析平衡结晶(Dialysis equilibrium crystallization)和等电点结晶(Isoelectric point crystallization)。还可以采用温度差结晶法、金属离子复合结晶法等进行酶的结晶。
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10.浓缩与干燥
浓缩与干燥都是酶与溶剂(通常是水)分离的过程。
(1)浓缩 浓缩(Concentration)是从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度酶液的过程。浓缩的方法很多。上面所述的离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂,如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分,也可以达到浓缩效果。
(2)干燥 干燥(Drying)是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分,以获得含水分较少的固体物质的过程。物质经过干燥以后,可以提高产品的稳定性,有利于产品的保存、运输和使用。
常用的干燥方法有真空干燥(Vacuum drying)、冷冻干燥(Freeze drying)、喷雾干燥(Spray drying)、气流干燥(Air-streaming drying)和吸附干燥(Adsorption drying)等。可以根据需要选择使用。
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