资源简介

(共35张PPT)
5.2.4酶固定化
1. 酶固定化概念
酶的固定化技术就是通过物理或化学方法将酶束缚在一定区间内制成仍具有催化活性的酶的衍生物即固定化酶(immobilized enzyme)。
酶是生物体为维持自身的生命活动而产生的，它适于在生物体内进行化学反应。但是，作为人类用于生产所需要的催化剂还不够理想。例如，酶在一般情况下，对热、强酸、强碱和有机溶剂等均不够稳定，即使给予合适的条件也会随着反应时间的延续，反应速度逐渐下降最后导致失括。同时，酶也不能反复利用且酶只能在水溶液中使用，不能在有机溶剂中使用。而固定化酶能克服上述的缺点，它像有机化学反应中所使用的固体催化剂一样，同时仍具有生物体内酶一样强的催化活性。
第5章现代环境生物技术原理
71
固定化酶具有下列优点：
1)可以使反应过程管道化、自动化，产物易从反应液中回收；
2)酶的稳定性有所改进；
3)酶的使用效率提高。
酶的固定化使酶的应用达到新的水平，可把酶直接应用于化学工业的反应系统。固定化酶的研究不仅具有实用价值，在探索酶的作用机制方面也提供了新的研究途径。
第5章现代环境生物技术原理
72
固定化酶的历史
固定化酶的研究开始于20世纪50年代。1953年格仑布霍费(Grubhofer)和施莱思(schleith)将聚氨苯乙烯树脂重氮化，并将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶或核糖核酸酶等结合固定到该树脂上，第一次实现了酶的固定化。经过十多年的努力，到了60年代后期，固定化酶已经广泛应用于食品、医药和发酵等工业的生产。1978年，我国首次使用固定化5’—磷酸二酯酶生产5’—核苷酸。到70年代初，出现了固定化细胞，细胞的固定化包括微生物细胞、动物细胞、植物细胞或各种细胞器的固定化。
第5章现代环境生物技术原理
73
固定化酶和固定化细胞研究的第一阶段主要是载休的开发，固定化方法的研究及其应用技术的开发。目前，第一阶段已基本完成，进入了第二阶段的研究。第二阶段的主要研究内容可归纳如下：①在需要辅酶(NAD+或FAD)或ATP、ADP、AMP的酶反应体系的固定化中，辅酶系或ATP、ADP、AMP系和其再生系的建立；②疏水体系或含水很低的体系里固定化酶的催化反应的研究；③为了防止固定化过程中酶活力下降，添加辅助物的研究：④固定化活细胞的研究。总之，酶和细胞固定化技术发展迅猛，它的应用将会引起应用酶学及生物工程学的巨大变革。
第5章现代环境生物技术原理
74
2.固定化酶的制备
酶的催化活性依赖于酶的空间结构及活性中心。所以在固定化时，要选择适当的条件，力图不使其活性中心的基团受到影响。操作时应尽量在温和条件下进行，避免高温、强酸、强碱处理，以尽量保持酶蛋白天然的高级结构。
酶固定化的方法很多，但没有一种对任何酶都适用的通用方法。目前采用的固定化方法大致可分为3类，载体结合法(包括共价结合法、离子结合法、物理吸附法)、交联法和包埋法（包括聚合物包埋法、微胶囊包埋法)。图5-7为几种常用的酶固定化方法示意图。
上述几种方法也可并用，称为混合法。例如：交联和包埋并用，离子结合和包埋并用，共价结合和包埋并用等。
第5章现代环境生物技术原理
75
图5-7 酶固定化方法示意图
(1)离子结合，(2)共价结合；(3)交联；(4)聚合物包埋；(5)疏水作用i(6)脂质体包埋；(7)微胶囊
第5章现代环境生物技术原理
76
（1）载体结合法
载体结合法(Carrier combination)是用共价键、离子键和物理吸附法把酶固定在纤维素、琼脂糖、左旋糖酐、甲壳质、多孔性玻璃和离子交换树脂等载体的固定化。
1）共价结合法
利用酶蛋白分子中的氦基酸残基与载体上的基团通过化学反应形成共价键而使酶固定化的方法。共价结合的具体方法很多，可分为重氮法、肽法、烷化法和载体交联法等。其中，重氮法最为常用。
共价结合法要求控制条件较苛刻，反应激烈，操作复杂，常常引起酶蛋白的高级结构发生变化，并导致活性中心破坏，难以制得高活力的标准品，有时会使酶原来具有的底物特异性发生变化。但此方法制得的固定化酶的酶分子和裁体间结合极牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液处理也不会使酶分子从载体上脱落。
第5章现代环境生物技术原理
77
2）离子结合法
通过离子效应，将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上。常用的载体有DEAF—纤维素、TEAE—纤维素、ECTROLA—纤维素及DEAE-交联葡聚糖等阴离子交换性载体。
与共价结合法相比较，离子结合法的操作简便，处理条件较温和，酶分子的高级结构和活性中心很少改变，可得到活性较高的固定化酶。但载体和酶分子之间的结合力不够牢固，易受缓冲液种类和pH的影响，在离子强度较大的状态下进行反应，有时酶分子会从载体上脱落下。
第5章现代环境生物技术原理
78
3）物理吸附法
是将酶分子吸附到不溶于水的惰性载体上。常用的载体有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高岭土、矾土、硅胶、磷酸钙凝胶、羟基磷灰石、淀粉等。其中以活性炭应用最广，例如把吸附有霉菌糖化酶的活性炭装入柱内，以适当流速道人淀粉溶液，流出液中可以获得葡萄糖。
物理吸附法不会明显改变酶分子的高级结构，因此不易使酶分子活性中心受到破坏。其缺点是酶分子与载体的相互作用较弱，被吸附的酶分子极易从载体上脱落。
第5章现代环境生物技术原理
79
（2）交联法
交联法(Covalention)是利用双功能试剂的作用，在酶分子之间发生交联，凝集成网状结构而制成的固定化酶。双功能试剂主要有戊二醛、顺丁烯二酸酐和乙烯共聚物。酶蛋白中游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。其中以戊二醛法最为常用。戊二醛和酶蛋白的游离氨基形成席夫(Schiff )碱而使酶分子交联。
交联法与共价结合法一样，反应条件比较剧烈，固定化酶的活力较低。又由于交联法制备的固定化酶颗粒较细，此法不宜单独使用，如与吸附法或包埋法联合使用好效果。又由于交联法制备，则可达到加固的良好效果。
第5章现代环境生物技术原理
80
（3）包埋法
包埋法(Embedding)是将酶包埋在聚合物凝胶的微细网格中或被半透性的聚合物膜所包围，使酶分子不能从凝胶的网格中或膜中漏出，而小分子的底物和产物则可以自由通过凝胶网格和半透膜。
1）聚合物包埋法
将酶包埋在聚合物的凝胶格中的方法。最常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、明胶、海藻胶等，其中以聚丙烯酰胺凝胶为最好。制备时，在酶溶液中加入丙烯酰胺单体和交联剂N，N’-甲叉双丙酰胺，在通入氮气的条件下，加聚合反应催化剂四甲基二胺和聚合引发剂过硫酸钾等进行聚合，酶分子便被包埋在聚合的凝胶内。
第5章现代环境生物技术原理
81
2）微胶囊法
微胶囊法（Microcapsule）是以半透性的高聚物薄膜包围含有酶分子的液滴。制备方法有3类：
界面聚合法
应用亲水性单体和疏水性单体在界面上发生聚合而将酶包围起来。
液中干燥法
把酶液在含有高聚物的有机溶剂中进行乳化分散，然后再把该乳化液转移到水溶液中，使之干燥，形成高聚物半透膜而将酶分子包裹起来。
相分离法
将聚合物溶解在不与水混溶的有机溶液中，然后将酶乳化分散在此溶液中，再在搅拌下徐徐加入引起相分离的非极性溶剂，聚合物的浓厚溶液将酶液包围，聚合物相继析出，形成半透膜，酶就被包裹在内。
第5章现代环境生物技术原理
82
包埋法操作简便，酶分子仅仅是包埋起来而未起化学反应．可用来制备各种固定化酶，一般酶活力较高。但有时在化学聚合反应时，需要在比较苛刻的条件下进行，容易导致酶的失话，所以要设计好包埋条件。另外，此法对作用于大分子底物的酶类不适用。
83
第5章现代环境生物技术原理
3.固定化酶的性质
游离酶在水溶液中，酶分子与底物分子同处于液相，几乎是十分邻近的。酶固定化后，酶分子牢固地结合于载体，处于与游离酶不同的微环境中，因此，固定化的结果往往引起酶性质的改变。原因主要来自两方面：一方面是酶本身的变化，主要由于活性中心的氨基酸残基、空间结构和电荷状态发生了变化；另一方面是载体的物理和化学性质的影响，主要由于在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体障碍的扩散层以及静电的相互作用等引起的。
第5章现代环境生物技术原理
84
固定化酶性质的变化主要表现在以下几方面：
（1）底物特异性的改变
同定化酶的活力一般比天然酶低，其底物特异性也可能发生变化。例如，用羧甲基纤维素作载体，肽法固定化的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的3％，而对低分子底物苯酰精氨酸—对-硝基酰替苯胺的活力保持100％。所以，一般认为酶被固定到载体后可引起立体障碍，使高分子底物与酶分子表面的邻近效应受到干扰，从而显著降低了酶的活性。而低分子底物则受到立体障碍的影响较小，底物分子容易接近酶分子，因而与原酶活力无显著差别。对以低分子物质为底物的酶，经固定化后，多数情况下底物特异性不发生变化。
第5章现代环境生物技术原理
85
（2）最适pH的改变
由带负电载体制备的固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH高，而用带正电载体制备的则情况相反，而用不带电的载体，最适pH不变(但也有最适pH改变的例子)。这可能解释为：当酶分子被结合到带负电(或带正电)载体上时，酶蛋白的阳离子(或阴离子)数增多，从而造成固定化酶反应区域的pH值比外部溶液的pH值偏酸(或偏碱)，这样，造成酶的反应是在比反应液的pH偏酸(或偏碱)一侧进行的，从而使最适pH值转移到碱性(或酸性)一侧。最适pH改变而pH活性曲线的形状不变的现象，称为最适pH的平行移动。
第5章现代环境生物技术原理
86
（3）最适温度的变化
酶固定化后，最适温度有时会发生变化。例如，以共价结合法固定化色氨酸酶的最适温度比固定化前高5-15℃，而以烷化法固定化氨基酰化酶的最适温度则比固定化前有所降低，多数情况下，最适温度并不发生变化。
（4）动力学常数的变化
酶固定化于电中性载体后，固定化酶的表观米氏常数往往比游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小。具有与载体电荷相反的底物由于静电相吸，固定化酶与游离酶相比，表观米氏常数往往减小。若载体与底物有一方不带电，则往住表观米氏常数不变或稍有增加。表观米氏常数的减少，对固定化酶的实际应用是有利的，可使反应更为完全。
第5章现代环境生物技术原理
87
（5）稳定性变化
酶固定化后，稳定性普遍增加，主要表现在对热的稳定性及贮藏的稳定性增加，且在蛋白质变性剂，如尿素、盐酸胍及有机溶剂中仍保持相当活性，对蛋白水解酶的抵抗性也增加等。这些特性都有利于酶的应用。
第5章现代环境生物技术原理
88
4.固定化酶反应动力学
酶经固定化后，其反应动力学( Reaction kinetics)发生显著的变化。固定化酶反应动力学较酶反应动力学复杂得多，影响因素也是多方面的，有些目前还处于研究探讨阶段。
⑴固定化对酶反应系统的影响
通常，大多数酶在固定化后，反应速度有所下降（个别除外）。其原因如下：
1）酶构象改变
由于酶分子在固定化过程中发生了某种扭曲，影响了酶分子的三维结构，导致酶与底物结合能力或酶催化底物转化能力的改变。
第5章现代环境生物技术原理
89
2）立体障碍
酶经固定化后，由于载体的存在，给酶的活性部位或调节部位造成了某种空间障碍，干扰与影响了酶与底物或其他效应物的接触。特别是当底物分子量较大时，影响就更大。
3）微扰效应
由于载体的疏水、亲水及荷电性质，使得紧邻固定化酶的环境区域（称微环境）发生变化，与宏观反应体系不同，对酶产生微扰效应，改变了酶的催化能力及酶对效应物作出调节反应的能力。
4）分配效应
由于底物与其他各种效应物（包括H十与OH一）和载体间产生了静电、亲水或疏水之类的相互作用，造成了它们在载体内外侧浓度的不等分配，从而影响酶反应速度。
第5章现代环境生物技术原理
90
5）扩散限制
酶固定化后，底物、产物和其他效应物在载体内外之间的迁移扩散速度受到了某种限制，造成了不等分布。扩散限制与这些物质的分子量大小、载体的结构及酶反应性质有关。
扩散限制分为外扩散限制和内扩散限制。
外扩散限制是指底物、产物和其他效应物在宏观体系与酶颗粒表面间的扩散受到了限制，此限制主要存在于酶颗粒周围的处于层流状态的液膜（Nernst）层。
内扩散限制是指在多孔性固定化载体内，底物、产物和其他效应物在载体颗粒表面与载体内的酶活性部位间的扩散受到的限制。
就外扩散限制来说，由于催化反应是在底物到酶活性部位以后才进行的，因此底物浓度在液膜层中的不等分布是线性梯度（产物浓度的不等分布也如此，但方向相反）。而就内扩散限制来说，由于催化反应与扩散过程几乎是同时进行的，所以底物在多孔载体内形成一种非线性梯度分布
第5章现代环境生物技术原理
91
以上各种原因是相互交叉、相互关联地存在着的，它们综合在一起决定着固定化酶的动力学性态。其中构象改变、立体障碍及微扰效应是直接影响酶的因素，这些因素对动力学的影响很难加以定量分析和概括，只能通过实验加以测定。它们的消除或改善只有依赖于选择合适的固定化条件、方法和载体。分配效应和扩散限制则是通过底物、产物和效应物在载体内外的不等分布来影响固定化酶的催化反应速度。
这里我们主要讨论分配效应和扩散限制效应对固定化酶动力学的影响。
第5章现代环境生物技术原理
92
⑵固定化酶反应动力学
假定酶被均匀地固定分布于载体内部，在稳定状态下进行不可逆的S → P 的反应。反应时，外部的流动状况不影响载体内部，底物一边扩散，通过载体内的细孔，一边进行反应，底物在转移过程中将逐渐消耗。因此底物浓度的分布以及单位体积载体中酶反应速度也将随载体表面到载体内部的距离的增大而降低，且降低是非线性的。我们可用微分底物衡算导出其反应速度方程。
在微小体积内进行微分底物衡算。因为整个反应系统是处于稳定状态。所以，单位体积底物的改变速度νs` 应该等于底物流入速度，即：
第5章现代环境生物技术原理
93
第5章现代环境生物技术原理
94
第5章现代环境生物技术原理
式5-11为直角座标系中的反应速度方程式。因为酶被均匀地固定在载体之中，而且，如果载体的形状为平板、圆柱、球状颗粒时，可分别取具有单体截面积的微小长方体、具有单位长度的微小圆环及微小球体来进行微分底物衡算（图5-8）。当只取x 轴（即r方向）来表示时，上述方程式为：
95
因为酶被均匀地固定在载体之中，而且，如果载体的形状为平板、圆柱、球状颗粒时，可分别取具有单体截面积的微小长方体、具有单位长度的微小圆环及微小球体来进行微分底物衡算（图5-8）。当只取x 轴（即r方向）来表示时，上述方程式为：
第5章现代环境生物技术原理
96
第5章现代环境生物技术原理
97
G为形状因子，平板为1，圆柱为2，球状颗粒为3。式5-12为二阶常数微分方程式，为了获得非零解，就需要两个边界条件。第一个边界条件是在球体中心，即：
第5章现代环境生物技术原理
这个条件下，在r=0处浓度分布可定义为对称，同时r=0又意味着没有扩散传递。
98
第5章现代环境生物技术原理
99
第5章现代环境生物技术原理
100
第5章现代环境生物技术原理
101
第5章现代环境生物技术原理
102
第5章现代环境生物技术原理
103
第5章现代环境生物技术原理
104
第5章现代环境生物技术原理
105

展开更多......

收起↑