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5.3.6 重组体DNA导入受体细胞
上述体外重组后的DNA，必须经过一定的方式导入细胞之中进行复制或表达所要研究的目的蛋白产物，DNA重组克隆的意义才能得以体现。重组体DNA转入宿主细胞，包括质粒DNA的转化、重组噬菌体的感染和重组DNA引入哺乳动物细胞转染几种类型。
1.转化
把外源DNA 分子导入细菌细胞的过程称为转化作用(Transformation)。 普遍地是指微生物通过摄取DNA而实现的基因转移。通过转化进入细胞的DNA可以同宿主菌发生重组，或者进行独立的复制。狭义的转化概念就是指细菌细胞的感受态捕获DNA和复制质粒载体DNA的过程。
携带基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞,并在其中稳定维持和表达。
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转化过程包括制备感受态细胞和转化处理。
感受态细胞(Competent cells)是指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。
（1）作为受体细胞的条件
1）有效受体细胞往往是DNA限制性内切酶缺陷型，使之不能随便切割、破坏重组载体DNA分子，保证了重组DNA分子稳定性。
2）作为受体细胞，应该不适于人体内生存，以及不适于非培养条件下生存；在非培养条件下，DNA易裂解及受体细胞无法生长等。
3）质粒载体对寄主专一性，并且这些受体细胞便于监视等。
为制备感受态细胞,应注意: a)在最适培养条件下培养受体细胞至对数生长期,培养时一般控制受体细胞密度 OD600在0 .4左右; b) 制备的整个过程控制在0～4℃;
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（2）感受态细胞的转化
细菌处于容易接受外源DNA的状态叫做感受态，大肠杆菌经过特殊的处理，可以形成感受态细胞。在分子克隆中，感受态细胞转化效率的高低是限制克隆成功率的一个重要因素。为提高转化率,目前制备各种细菌感受态的最常用方法是低温CaCl2法，转化效率一般为(106-107)个转化子/μgDNA，该方法操作简便，且重复性好。
大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体,需经诱导才能变成感受态细胞,而有些其他细 胞自然就可变到感受态,或改变培养条件和培养基就可实现这种转变。
目前已有商品化的感受态细胞出售，但价格较为昂贵。
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2 .高压电穿孔法
电穿孔法( Electroporation) 就是把宿主细胞置于一个外加电场中,通过电场脉冲在细胞壁上打孔,DNA分子随即进入细胞。
电穿孔法的转化效率可达(109—1010)个转化子/μg DNA，明显高于低温CaCl2法，但需要专用的电穿孔仪。酵母细胞的转化多采用电穿孔法。
电穿孔方法也因菌而异,通过调节电场强度、电脉冲的频率和用于转化的DNA浓度可将外源 DNA导入细菌或真核细胞。其基本原理是:在适当的外加脉冲电场作用下,细胞膜(其基本组成为磷脂)由于电位差太大而呈现不稳定状态,从而产生孔隙使高分子(如ATP)和低分子物质得以进入细胞质内,但还不至于使细胞受到致命伤害, 当移动外加电场后,被击穿的膜孔可自行复原。
电压太低时DNA不能进入细胞膜,电压太高时细胞产生不可逆损伤,故应在300～600V 为宜。以时间20～100ms,温度0℃为宜,使穿孔修复迟缓,DNA进入机会多。
用电穿孔法实现基因导入比CaCl2转化法方便。对细菌而言,其转化率可高达109～1010 转化体/微克DNA。该法需专门仪器,目前已有多家公司出售。
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3.多聚物介导法
聚乙二醇(PEG)和多聚赖氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物,尤以PEG 应用最广。这些多聚物同二价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+等)和DNA混合,可在原生质体表面形成颗粒沉淀,使DNA进入细胞内。
这种方法常用于酵母细胞以及其他真菌细胞。处于对数生长期的细胞或菌丝体用消化 细胞壁的酶处理变成球形体后,在适当浓度的聚乙二醇6000 (PEG 6000)的介导下将外源 DNA导入受体细胞中。
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4 .磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染法
这是将外源基因导入哺乳类动物细胞进行瞬时表达的常规方法。
磷酸钙转染法的基本原理是: 哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉 淀物,使 DNA转入细胞。
先将重组 DN 同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液,随后与磷酸钙形成DNA-磷酸钙沉淀,粘附在细胞表面,达到转染目的。
被感染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后通过内吞作用进入受体细胞。
DEAE-dextran( 乙胺乙基葡聚糖)是一种高分子质量的多聚阳离子试剂, 能促进哺乳动物细胞捕获外源 DAN分子。对于其作用机制尚不清楚,可能是其与 DNA结合从而抑制核酸酶的作用或细胞结合从而促进 DNA的内吞作用。
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5.原生质体融合法
将带重组质粒的细菌原生质体同受体细胞进行短暂的共培养,经过细胞膜融合,将重组 DNA导入细胞。
6 .脂质体介导法
脂质体(Liposome )是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构,把用来转染的DNA分子包在其中,通过脂质体与细胞接触,将外源 DNA 分子导入受体细胞。其原理为: 细胞膜表面带负电荷,脂质颗粒带正电荷,以电荷间引力将 DNA、mRNA及单链RNA导入细胞内。该法的优点是稳定、温和。
7.显微注射法
利用哺乳动物细胞便于注射的特性,将外源 DNA分子通过显微注射法直接注入细胞。
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8 .粒子轰击法
金属微粒在外力作用下达到一定速度后,可以进入植物细胞,但又不引起细胞致命伤害,仍能维持正常的生命活动。利用这一特性,先将含目的基因的外源 DNA同钨、金等金属微粒混合,使 DNA吸附在金属微粒表面,随后用基因枪轰击,通过氦气冲击波使 DNA随高速金属微粒进入植物细胞, 粒子轰击法(Particle bombardment)可直接处理植物器官或组织,是当今普遍应用的植物转基因方法。
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9 .激光微束穿孔法
利用直径很小、能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理, 用激光处理细 胞,处于细胞周围的重组 DNA随之进入细胞。
此方法适用于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。
总之,基因导入的方法多种多样,可根据具体要求进行选择。具体操作可参考有关实验手册。
10.重组噬菌体的感染
噬菌体或病毒进入宿主细胞并进行繁殖的过程称为感染（Infection）。在以重组噬菌体作为载体进行基因导入时，通过在体外将噬菌体外壳蛋白与重组体包装成有活力的噬菌体，
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5.3.7重组体的筛选
目的基因和载体重组由于操作的失误及不可预测因素的干扰等,并非能全部按照预先设计的方式重组, 宿主都不可能百分之百地被转化（Transformation）、感染（Infection）或转染(Transfection)，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分,而绝大部分仍是原来的受体细胞,或者是不含目的基因的克隆子(Clone child)。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子,目前已建立起一系列根据重组体的各种不同特征的筛选和鉴定的方法,概括起来有三类:
①生物学方法,包括遗传学方法、免疫学方法和噬菌斑的形成等;
②核酸杂交, 通过DNA-DNA、DNA-RNA碱基配对的原理进行筛选,以探针的使用为核心,包括原位杂交、Southen杂交、Northen杂交等;
③物理方法, 如用电泳法等。
不论哪一种筛选方法,最终目的是要证实基因是否按照人们所要求的顺序和方式正常存在于宿主细胞中。
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1.生物学方法
(1 ) 遗传学方法
1)利用抗生素抗性基因
质粒常有抗药性基因,如四环素抗性基因 (Tetr)、氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、卡那霉素抗性基因( Kanr) ,当编码有这些抗药性基因的质粒携带目的DNA进入宿主细胞后,便可在内含这些抗菌素的培养基中生长。
但必须清楚地认识到,筛选的目的是要证实携带有目的 DNA的质粒存在而非是单独这类质粒存在,因为不携带目的基因质粒进入宿主与 DNA重组无关。
为了防止这一误检,人们采用插入缺失的方法, 即在体外故意将目的 DNA插入到原质粒的某个抗性基因之中,使其失活,这样,由此得到宿主细胞便可在内含这一抗菌素的培养基中存活,其余的被抑制或杀灭,这一方法称为插入失活检测法（Insertion inactivation detection method）。
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在实际操作中,同一质粒往往有两种抗药性基因,其中一个插入失活后,另一个仍完整存在,故筛选时要经过两次才能确认是其中一个抗药性基因被插入,这样就显得较麻烦。
例如pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因,抗氨苄青霉素基因(Ampr)上有单一的PstⅠ位点,抗四环素基因(Tetr)上有SalⅠ和BamHⅠ位点。当外源 DNA片段插入到SalⅠ/ BamHⅠ位点时,使抗四环素基因失活,这时含有重组体的菌株从Ampr Tetr变为Ampr Tets。这样,凡是在Ampr平板上生长的菌落,而在Ampr、Tetr平板上不能生长的菌落就可能是你所要的重组体,如图5-37所示。
此外,有时小片段的DNA插入不能导致一些抗性基因失活,可能是这种插入不破坏此基因的阅读框所致。
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利用抗药性基因进行筛选的另一方法是直接筛选法(Direct screening method)。由于在一种质粒上往往具有两种抗药性基因,用插入失活检测法时要在分别含两种抗生素的平板上进行筛选,为了做到在一个平板上直接筛选,可将插入缺失重组后转化的宿主细胞培养在含四环素和环丝氨酸的培养基中,重组体Tets生长受到抑制, 非重组体Tetr虽能使细胞生长,但因环丝氨酸可在蛋白质合成时掺入而导致细胞死亡,受到抑制的重组体Tets因仅仅是受抑制,故接种到另一培养基中时便可重新生长。
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2)营养缺陷互补法
宿主细胞在营养代谢上缺什么基因,重组后进入的外来DNA同时补充什么基因。由此实现营养缺陷互补。如宿主细胞有的缺少亮氨酸合成酶基因,有的缺少色氨酸合成酶基因,这一方法使用选择性培养基,实际上就是恰好缺少宿主细胞不能合成的那种物质。由插入失活而来的一种更直观的检测方法是β-半乳糖苷酶显色反应。
用于宿主为lacZ基因缺陷的大肠杆菌,正常情况下大肠杆菌的乳糖操纵子中lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶分解乳糖为半乳糖和葡萄糖,当用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)代替乳糖为诱导物时,如果插入的外源 DNA使处于质粒上的lacZ 基因失活, 则重组细胞不能使乳糖水解。而内含IPTG的培养基同时含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷( x-gal),x-gal 相当于乳糖, x-gal 被水解,菌落呈蓝色,否则无色。要使x-gal 被水解,处于质粒上的lacZ 基因和缺少lacZ 基因的宿主大肠杆菌应相互补。由于lacZ 基因处于乳糖操纵子的前59个密码子区段,一般称为α序列, 故称这种互补为α互补。无α互补,无 x-gal水解,便无蓝色出现。
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例如pUC质粒载体含有β-半乳糖苷酶基因(lac Z′)的调节片段。具完整乳糖操纵子的菌体能翻译β-半乳糖苷酶(z),如果这个细胞带有没有插入目的DNA的pUC19质粒,当培养基中含有IPTG时, lacI的产物就不能与lac Z′的启动子区域结合,因此,质粒的lac Z′就可以转录,进而翻译。lac Z 蛋白会与染色体DNA编码的一个蛋白形成具有活性的杂合β-半乳糖苷酶,当有底物x-gal存在时, x-gal会被杂合的β-半乳糖苷酶水解成一个蓝色的底物,即那些带有没有插入外源 DNA片段的 pUC 19质粒的菌落呈蓝色。如果pUC 19质粒中插入有目的 DNA片段,那么就会破坏lac Z′的结构,导致细胞无法产生功能性的lac Z 蛋白,也就无法形成杂合β-半乳糖苷酶,因而菌落是白色的。由此可以根据菌落的蓝、白颜色,筛选出含目的基因的重组体。这一方法大大简化了在这种质粒载体中鉴定重组体的工作。
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（2）免疫学方法
免疫学方法(Immunological Method)是一个专一性强、灵敏度高的检测方法。在某些情况下,如待测的重组体既无任何基因表现特征,又无易得的杂交探针,那么免疫学方法则是筛选重组体的重要途径。使用这种方法的先决条件是重组基因可在受体细胞内表达,并且有目的蛋白的抗体。
用自制或现有的同位素或其他方法标记的抗体和目的基因表达产物进行免疫反应,因 宿主不同,非分泌型的宿主要对其菌落进行溶解和固定( 原位放射免疫反应),分泌型的可进 一步对蛋白质进行电泳分离,然后在膜上固定,固定后的表达产物然后进行免疫反应。如果直接在培养基上进行免疫反应(沉淀法),在菌落周围将产生白色沉淀圈。
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（3）利用噬菌斑筛选
λ载体中重组的外源DNA达到λDNA的75%～105%长度时,进入λ宿主的重组的载体会在培养平板上形成清晰的噬菌斑(Plaque),所以噬菌斑的形成不仅要使重组后的λ体进入宿主,而且要使重组后的λ载体能自动包装成有活性的噬菌体颗粒。
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2.核酸杂交法
利用碱基配对的原理进行分子杂交(Molecular hybridization)是核酸分析的重要手段, 也是鉴定基因重组体的常用方法。
核酸杂交法的关键是获得有放射性或非放射性但有其他类似放射性的探针,探针的 DNA或RNA顺序是已知的。
根据实验设计,先制备含目的DNA片段的探针,随后采用杂交方法进行鉴定。
核酸分子杂交的方法有多种,如原位杂交、点杂交、Southern杂交等。
核酸分子杂交的基本原理是:具有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA分子,当它们混合在一起时,其特定的同源区将会退火形成双链结构。利用放射性同位素32P标记的DNA或RNA作探针进行核酸杂交,即可进行重组体的筛选与鉴定(图5-38) 。
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32P 标记的脱氧核糖核苷三磷酸的结构式如图5-39所示。
为了操作方便,在大多数核酸杂交反应中,核酸分子都要转移或固定在某种固体支持物 上。常用的固体支持物有:醋酸纤维素滤膜、重氮苄氧甲基(DBM)-纤维素、氨基苯硫醚 (APT)-纤维素、尼龙膜及滤纸等。
在核酸杂交中固体支持物的选择取决于以下因素:a )核酸的特性,如分子的大小;b )杂交过程中涉及到步骤的多少;c )杂交反应的灵敏度等。
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(1 )原位杂交
让含重组体的菌落或噬菌斑由平板转移到滤膜上并释放出DNA,变性并固定在膜上,再同DNA探针杂交的方法称为原位杂交(in situ hybridization)。
原位杂交可分为原位菌落杂交(In situ colony hybridization)和原位噬菌斑杂交(In situ plaque hybridization),二者的基本原理是相同的。
将转化后得到的菌落或重组噬菌体感染菌体所得到的噬菌斑原位转移到硝酸纤维素滤 膜上,得到一个与平板菌落或噬菌斑分布完全一致的复制品。通过菌体或噬菌体裂解、碱变 性后,通过烘烤(约80℃)将变性DNA不可逆地结合于滤膜上,这样固定在滤膜上的单链DNA 就可用各种方法标记的探针进行杂交。通过洗涤除去多余的探针,将滤膜干燥后进行放射自显影。最后将胶片与原平板上菌落或噬菌斑的位置对比,就可以得到杂交阳性的菌落或噬菌斑(见图5-40 )。
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（2） Southern杂交
将重组体DNA用限制酶切割,分离出目的DNA 后进行电泳分离,再将其原位转至薄膜上,固定后用探针杂交的方法称为Southern杂交。
原理是根据 DNA分子中两条单链核苷酸互补的碱基序列能专一地按AT,CG配对,即在一定条件下单链 DNA上的碱基与另一链上的碱基形成氢键,从而使两条单链杂交变成双链DNA分子。
该方法与原位杂交的最大区别是:用于杂交的核酸需经分离、纯化、限制酶解、凝胶电泳分离,然后转移到硝酸纤维素滤膜等固体支持物上,再与相应的探针杂交。凝胶中DNA片 段的相对位道在DNA转移到滤膜的过程中继续保持着,而滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交,通过放射自显影确定与探针互补的每一条带的位置,从而可以确定某一特定序列DNA片段的位置与大小(图5-41 )。
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在分子杂交中,将DNA从凝胶转移到固体支持物上的常用方法有:a)毛细管转移法;b)真空转移法; c)电转移法。
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3. 印迹技术
以PAGE为基础的电泳法是检测蛋白质等生物大分子的一项重要技术。由于聚丙烯酰胺凝胶易破损断裂,经不起检测过程中的各种物理及化学处理,因此,若直接在凝胶上检测则十分困难。
将完成PAGE后的分离区带转移到特定的固相膜上产生印迹,然后再用各种方法检测,对这些印迹进行分析鉴定,以检出所需的某一组分。
将分离区带转移到固相纸膜上可以方便后续的检测。由于这一过程与墨迹被吸印到吸 墨纸上的过程类似,所以称之为印迹法(Blot ting )。
印迹技术中使用的固相纸膜的特点如下:
a)质地柔软,耐用,可长期保存;
b)具有化学基团,可与生物大分子结合。
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常用的有硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membrane )。
印迹转移后,可利用抗原-抗体、酶-底物、DNA-相应RNA等物质间的特异亲和力,以这些成对物中的一方作探针,进行标记, 如酶标记、荧光标记、放射性同位素标记、特异性染色等。印迹技术是一种分析、鉴别生物大分子的有效技术。
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