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5.3基因工程基本原理
1.基因工程的诞生
现在人们公认,基因工程诞生于1973年,它是数十年来无数科学家辛勤劳动的成果、智 慧的结晶。从20世纪40年代起,科学家们从理论和技术两方面为基因工程的产生奠定了坚实的基础。概括起来,从20世纪40年代到70年代初基因工程诞生,现代分子生物学领域理论上的三大发现及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用。
(1) 现代分子生物学理论上的三大发现
1）生物遗传物质DNA的发现
1934年, O.T.Avery在一次学术会议上首次报道了肺炎双球菌 ( Diplococcus pneumoniae)的转化。研究成果不仅证明了遗传物质是DNA而不是蛋白质，解决了遗传信息的来源问题，而且也证明了DNA可以把一个细菌的性状转给另一个细菌,理论意义十分重大。Avery的工作是现代生物科学革命的开端,是基因工程的先导。
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5.3.1基因工程概述
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2）DNA双螺旋结构
1953年, Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构。随后X射线衍射证明DNA具有规则的螺旋结构,阐明了信息载体DNA的复制并解决了信息传递的方式问题。
3）遗传信息传递方式的确定
1961年, J.Monod和F. Jacob提出了操纵子学说。以Nireberg为代表的一批科学家,经过艰苦努力,确定了遗传信息是以密码方式传递的,每三个核苷酸组成一个密码子,代表一个氨基酸。到1966年,全部破译了64个密码,编排了密码字典,叙述了“中心法则”,提出遗传信息流,即DNA→RNA→蛋白质。从分子水平上揭示了遗传现象。
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(２) 现代分子生物学领域技术上的三大发明
1）工具酶
Smith 、Wilcox（1970）和Boyer（1972）等发现了限制性核酸内切酶和Khorana(1970)等发现了DNA连接酶，使DNA分子的切割和连接成为可能，从而为基因工程的技术操作奠定了良好的基础。
2）载体
Lederberg(1946) 发现细菌的F-性因子，以后相继发现和建立了其它外源基因运载体，Cohen（1973）首次将质粒作为基因工程的运载体使用。
3）反(逆) 转录酶
Baltimore和Temin(1970)等人发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。
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具备了以上的理论与技术基础，基因工程诞生的条件已经成熟。
1972年Berg (伯格)等人在世界上首次进行了DNA的体外重组，得到了包含SV40和λDNA的重组DNA分子。
1973年Cohen(科恩)等人将编码卡那霉素的质粒DNA和编码四环素抗性的基因进行重组并转化大肠杆菌，结果转化菌同时表现出了卡那霉素和四环素的双重抗性，至此基因工程技术宣告诞生。
随着分子生物学基础技术的发展，随后又出现了杂交技术、序列测定技术、PCR技术等一系列新技术，从而使基因工程技术日臻完善，
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2.基因工程的定义
将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内,使这个基因能在受体细胞内复制、转录、 翻译表达的操作称为基因工程（Genetic engineering）。
基因工程包括基因的分离、重组、转移以及基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程。
基因工程又称DNA重组技术,是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术,基因工程的实施至少要有四个必要条件：a ) 工具酶 ;b ) 基因;c ) 载体;d ) 受体细胞.
从本质上讲,基因工程强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的宿主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按照工程学的方法进行设计和操作的。这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力,克服了固有的生物种间的限制,扩大和带来了定向创造新物种的可能性。这是基因工程的最大特点。
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基因工程问世以来,各种名称相继问世,在文献中常见的有遗传工程(Genetic engineering )、基因工程(Gene engineering )、基因操作(Gene manipulation )、重组DNA技术(Recombinant DNA technique)、分子克隆( Molecular cloning )、基因克隆( Gene cloning)等, 这些术语所代表的具体内容彼此相关,在许多场合下被混同使用,难以严格区分,不过它们之间还是存在一定的区别。
上述概念针对的都是DNA。遗传工程、基因工程、DNA 重组之间的差别在于: 遗传工程是发生在遗传过程中的自然界原本存在的导致变异的一种现象,即自然出现的不同DNA 链断裂并连接成新的DNA分子,新的DNA分子含有不同于亲体的NDA片段; DNA重组是人们根据遗传工程原理利用限制性内切酶在体外对DNA进行的人工操作,即采用酶法,将来源不同的DNA进行体外切割与连接,构成杂种DNA分子,在自然界一般不能自发实现;基因工程是遗传重组和DNA重组的目的和结果,无论是利用自然的(遗传重组)还是人工的(DNA重组) ,最终目的是要实现基因重组。从操作对象是DNA说来, DNA重组是本质和根本的。所以, DNA重组在广义上包括了遗传重组和基因重组。
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克隆(Clone) 一词,当作为名词时,是指从同一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代,或 具有相同遗传性状的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。当作为动词时, 是指从同一祖先生产这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。
在体外重组DNA的过程中,以能够独立自主复制的载体为媒介, 把外源DNA (片段)引入宿主细胞进行繁殖。实质上是从一个DNA片段增殖了结构和功能完全相同的DNA分子群的过程,也是为遗传同一的生物品系(它们都带有重组DNA分子 )成批地繁殖和生长提供了有效的途径。因此,基因工程也称为基因克隆或DNA分子克隆。
目前基因工程的发展极为迅速，为生物学、医学、农学和环境科学等学科的理论研究及工业、农业和人类日常生活都带来了革命性的变化，其意义毫不逊色于有史以来任何一次技术革命，概括起来体现在以下三个方面：①用于大规模生产生物分子；②改造现有物种及设计构建新物种；③寻找、分离和鉴定生物体的遗传信息资源。
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3.基因工程的主要内容
集中反映基因工程内容的核心是ＤＮＡ 重组技术，概括而言，一个完整的体外DNA重组过程主要包括以下步骤：
1）获取目的基因并进行必要的改造
2）选择合适的载体并加以适当的修饰
3）将目的基因与载体连接，获得含有目的基因的重组载体
4）将重组载体导入相应细胞(称为宿主细胞)并筛选出合重组DNA的细胞
如图5-17所示。
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获得含有重组载体的细胞后，通过大量培养重组细胞，可以获得目的基因的大量拷贝或目的基因的表达产物。通常将来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物称为克隆，获取大量单一克隆的过程称为克隆化，也称无性繁殖。
广义的重组DNA技术不仅包括DNA体外重组技术及操作过程，还包括表达产物的后续处理过程和技术，如：蛋白质的分离纯化、
4.基因工程操作的基本技术
基因工程的基本实验方法,除密度梯度超速离心、电子显微技术之外,还有DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、DNA序列结构分析和基因的人工合成等多种新技术新方法。
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5.3.2目的基因的获得
基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组,获得具有高度应用价值的新物 种。为此,须从现有生物群体中,根据需要分离出可用于克隆的此类基因。这样的基因通常称为目的基因 (待检测或待研究的特定基因)。
基因（遗传因子、遗传基因）指携带有遗传信息的DNA序列，是控制性状的基本遗传单位，亦即一段具有功能性的DNA序列。根据功能的差异,基因可分为结构基因、调节基因和操纵基因。
结构基因（Structural gene）决定某一种蛋白质分子结构相应的一段DNA, 可将携带的特定遗传信 息转录给mRNA , 再以mRNA为模板合成特定氨基酸序列的蛋白质。
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调节基因(Regulator gene) 调节基因带有阻抑蛋白, 控制结构基因的活性。平时阻抑蛋白与操纵 基因结合,结构基因无活性,不能合成酶或蛋白质,当有诱导物与阻抑蛋白结合时, 操纵基因 负责打开控制结构基因的开关,于是结构基因就能合成相应的酶或蛋白质。
操纵基因(Operator gene) 操纵基因位于结构基因的一端,与一系列结构基因合起来形成一个操纵子。
作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转录启动子(Transcriptional promoter)、基因编码区和转录终止子。
启动子是 DNA上 RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列。转录mRNA 的第一个碱基被定为转录起始位点。基因编码区包括起译码ATG、开读框和休止码TAA (或TAG、TGA)。终止子是一个提供转录停止信息的核苷酸序列。
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目的基因主要是结构基因。目前获得目的基因(Target gene )的方法主要有以下几种:
1.从基因组DNA中分离
此法适用于结构简单的原核生物中的多拷贝基因，可直接从组织或供体中用理化方法或合适的限制性内切酶将DNA消化后分离获得。
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(1)基因的随机断裂方法
采用一定的理化方法将基因组DNA随机断裂，可以得到大小基本一致的DNA片段。这些方法有用专一性核酸酶酶解，化学处理或普遍使用的机械切割法。DNA在溶液状态是呈细长线性分子，刚性强，在受到机械剪切作用时很容易断裂。用超声波处理DNA溶液，可得到平均长度在一定范围的DNA片段，使用组织捣碎，控制一定的条件，也可以使基因组DNA得到可控的剪切，如在1500rpm下，捣碎30min，可以得到平均大小为8kb的DNA片段。
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（2）限制性内切酶降解
一般多采用“鸟枪法（Shotgun method）”，即限制性内切酶部分酶解法（Restriction endonuclease）。限制性内切酶降解所产生的片段的长短与其识别序列的长短直接相关。理论上讲，一个识别几个碱基的限制酶位点在基因组的分布几率为1/4n(n为限制性内切酶所识别的特异序列中的核苷酸个数)，因此采用基因组DNA进行限制酶的不完全酶解，可以得到长短不一的片段，用于构建基因文库。
基因文库 (Genomic DNA library)是指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆,所产生的克隆群体代表了基因组 DNA的所有序列。
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基因组 DNA文库有着非常广泛的用途,如用以分析、分离特定的基因片段,通过染色体步查( Chromosome walking) 研究基因的组织结构,用于基因表达调控研究,用于人类及动植物基因组工程的研究等。
一个完整的基因文库应该包括目的生物体所有的基因组DNA。
由于限制性内切酶的位点在基因组 DNA上并不是随机排列的,有些片段会太大而无法克隆,这时文库就不完整。要找到一些特异的目的DNA片段就要难一些。
限制性内切酶对总DNA酶解如图5-18所示。
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2.基因的化学合成法
化学合成法(Chemical Synthesis)是利用自动DNA合成仪直接合成基因序列的方法，适合于长度较短的基因，其前提条件是:该基因的核苷酸序列已知。对于较大的基因，可以分段合成DNA短片段，再经过DNA连接酶作用依次连接成一个完整的基因链。目前核酸的合成方法中，固相合成法是最为常用的。其原理是：首先将寡核苷酸链3′末端的第1个核苷酸先固定在一个不溶性的高分子(例硅胶微粒)上；然后，从此末端开始逐一加上脱氧核苷酸以延长DNA链，每延长1个核苷酸经历1个循环，合成的核苷酸被固定在固相载体上，而过量的未接上的反应物或分解物则经过过滤或洗涤除去；至合成所需的长度后，再将寡核苷酸链从固相载体上洗脱，经分离纯化后得到所需的最后产物,DNA化学合成的具体过程如图5-19所示。
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为了保证 DNA化学合成的产量,要求每步的效率都在98%以上(表5-9),所以在反应过程中要对偶联效率加以监控。常用的方法是利用分光光度计检测每步反应中脱下的三苯甲基的浓度,从而推测出反应的效率。
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3通过RNA合成cDNA
以从细胞中提取的mRNA为模扳，借逆转录酶反转录生成cDNA（互补脱氧核糖核酸 ，complementary DNA），然后进行基因克隆，从而获得某种特定基因。合成cDNA技术的应用不仅依赖于分离得到相当纯的mRNA，而且还取决于mRNA的含量。如果—种mRNA在总则RNA中的含量高，就比较容易提取纯化。反之如果—种mRNA在总则RNA中的含量低，直接获得就相当困难。近年来采用与PCR反应联合应用的方法，大大提高了cDNA克隆的成功率，这已经成为目前获得已知基因的主要方法。cDNA 合成原理如图5-20所示。
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4.用聚合酶链反应(PCR)方法扩增目的基因片段
聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR)是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。它的基本原理是以分别位于待扩增DNA区段两侧的两段序列互不相同并分别与模板DNA两条链上的各一段互补的寡核苷酸为引物。反应分三步：
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1)变性(denaturation)-通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；
2)退火(annealling)-随之将反应混合液突然冷却至某一温度，反应体系中摩尔数大大过量的引物DNA可与其互补的模板在局部形成杂交链；
3)延伸(extension)-在DNA聚合酶、4种dNTP底物及Mg2+存在下，催化以引物为起始点的5’→3’的DNA链延伸反应。如此反复进行变性、退火和DNA合成的循环，新合成的DNA链又成为下一轮循环的模板，这一周而复始的过程每完成一个循环，基本上目的DNA就增加1倍，使介于两个引物间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106-7拷贝，反应步骤如图5-21。
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(a)起始材料是双链DNA分子；(b)反应混和物加热后发生链的分离，然后冷却使引物结合到位于待扩增的靶DNA区段两端的退火位点上；(c)Taq聚合酶以单链DNA为模板在引物的引导下利用反应混合物中的dNTPs合成互补的心链DNA；(d)将反应混合物再次加热，使旧链和新链分离开来，这样便有4个退火位点可供引物结合，其中两个在旧链上，两个在新链上（为了使图示简化，在以下略去了起始链的情况）；(e)Taq聚合酶合成新的互补链DNA，但这些链的延伸是精确地局限于靶DNA序列区，因此这两条新合成的DNA链的跨度是严格地定位在两条引物界定的区段内； (f)重复过程，引物结合到新合成的DNA单链的退火位点（同样也可以形成不同长度的链，但为间接起见，图中略去了这些链）；(g)Taq聚合酶合成互补链，产生出两条与靶DNA区段完全相同的双链DNA片断
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正由于PCR可以在简便的条件下使目的DNA片段在很短时间内迅速得到数量级的扩增，因此PCR技术越来越广泛地被运用在生物学、医学、环境监测等研究领域，已成为用途极为广泛的一项生物技术。利用PCR技术可以直接从染色体DNA或cDNA快速简便地获得待克隆的目的基因片段，快速地进行外源基因的克隆操作。PCR技术扩增目的基因的前提是必须知道目的基因片段两侧或附近的DNA序列，并据此合成扩增引物。由PCR体外扩增的片段可经克隆作进一步分析用，也可直接纯化作各种探针用。该法也解决了微量基因片段的来源问题。
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5.基因文库与cDNA文库的构建
大部分未知基因不能用上述方法获得，需要先构建文库，再经筛选获得目的基因。文库分为基因文库和cDNA文库两种。
基因文库(Genomic library)是指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体。构建基因组文库时，先将细胞染色体DNA提纯，用限制性内切酶将染色体DNA切割成大小不等的许多片段，与同一类载体拼接，继而转入受体菌扩增，这样就构建了含有多个克隆的基因组DNA文库。基因组DNA文库理论上可以涵盖基因组的全部基因信息。
如果以细胞总mRNA为模板，经反转录生成互补DNA(cDNA)，酶切后的DNA片段与合适的载体连接，转入受体菌，这样建立的就是cDNA文库(cDNA library)。cDNA文库理论上包含了细胞全部mRNA信息，可以利用适当方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA，这是获取结构基因的主要方法。
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第5章现代环境生物技术原理
基因文库与cDNA文库的构建步骤如图5-22所示。
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