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5.3.3基因工程载体
能承载体外源DNA片段(基因)并带入受体细胞的传递者称为基因工程载体 ( Vector)。
1.基因工程的载体的必备条件
(1 ) 能够进入宿主细胞
载体能够进入宿主细胞的原因是本身很小。和宿主的染色体DNA分子相比,载体的大小显得微乎其微。如细菌的质粒一般为 1～200 kb ,而大肠杆菌细胞的DNA分子为 4×106bp,质粒仅占大肠杆菌 DNA分子的1/ 20。SV40的DNA相对分子质量为3×106 ,而高等生物染色体 DNA 相对分子质量一般都在 1×1012 Da以上, 前者仅占后者的 1/ (3×105 )。 载体能够进入宿主细胞的另一个原因是目前已知的这些载体均不具备独立生存的能力,载体本身是以 DNA或RNA为主,甚至全为 DNA或 RNA,而且是一个分子结构。载体进入宿主细胞,相当于一个分子进入细胞。
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按照来源不同，可以将载体分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体和人工染色体载体等类型；按照用途不同，可将载体分为克隆载体和表达载体。以下简要介绍几类常用的载体。
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(2 ) 载体可以在宿主细胞中独立复制,即本身是一个复制子
一个载体必须在其 DNA分子中包含复制起点,利用自己编码或借用宿主的复制酶进行复制,否则就不能在宿主细胞中长期存在下去。当外源 DNA插入时, 插入外源 DNA片段的大小和插入的量都不能破坏载体原有复制能力。人工重组后的载体在一个宿主细胞中起初可能只有一个,但经过复制后可实现多拷贝,这即是基因克隆。没有足够的外源 DNA的拷贝数,则筛选重组体是不可能进行的,高效表达也不能很好实现。
(3 ) 要有筛选标记
区分重组与否要靠筛选标记来进行。携带有外源 DNA的载体进入宿主细胞与否以及进入后复制与否全靠筛选标记提供帮助。
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(4 ) 对多种限制酶有单一或较少的切点,最好是单一切点
限制酶切点是外源 DNA插入、载体 DNA开环和闭环的基础。不能用于重组的载体是 DNA 的无效载体。
携带外源 DNA的载体进入宿主细胞后无非以两种状态存在:
1 ) 结合态
载体和宿主染色体 DNA整合在一起, 单拷贝,被整合的可以是载体本身加外源DNA,也可以是一部分,但至少要将外源DNA整合;
2 ) 并存
即独立存在于宿主细胞中,多拷贝。
也有两种状态兼有的。哪一种状态有利要依DNA重组的目的而言, 如果是为了稳定遗传,单拷贝的整合型为妥;如果为了基因克隆,则需要多拷贝型。
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随着DNA重组技术的不断改进,对载体的要求正在逐步发生改变。上述基本要求主要是从原核生物 DNA重组中得出的。到了真核生物阶段,由于将外源 DNA引入宿主的方法有了新的改进,例如各种细胞学方法、物理方法的引进, 引入外源 DNA时已大大突破了原有的要求重组 DNA片段的大小限制。人们迫使外源 DNA 进入宿主的能力增强了。此外,由于筛选重组体技术的改进,原来要求载体或外源 DNA上有选择标记已经被杂交技术、免疫学技术等替换,从而扩大了DNA重组技术使用的范围。
因此,作为DNA重组的载体最基本的要求有两条: ① 自主复制能力;② 可利用的限制 酶切点。其他要求在有些载体中已不存在。
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2. 基因工程载体的分类
通过对各种载体的了解,还可以看出, DNA 重组使用的载体可以分为三大类。
1 ) 第一类是以繁殖 DNA片段为目的的载体,通常称为克隆载体。这类载体较小,复制不受寄主的严格控制,即自身有很强的复制能力,在细胞内可以有很高的拷贝数,寄主的DNA 复制停止时,这类载体仍能扩增。pBR322 系列、pUC 系列、M13 系列载体均属于克隆载体。
2 ) 第二类载体为穿梭载体,既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖。说明这类载体有真核细胞和原核细胞两种复制点。穿梭载体常用于真核生物 DNA片段在原核生物中的繁殖,然后再转入真核细胞宿主。
3) 第三类载体为表达载体。在基因工程中,人们进行DNA重组的目的是要获得表达产物。目的基因不仅要进入宿主,而且要高效表达,其要求很高。
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这里强调要特别注意载体这个概念的使用, 通常所说的载体是指将外源或目的DNA携带进宿主的运载者,但在基因重组表达时,也常将表达系统-宿主称为载体。要注意二者的区别,不可混淆起来。
基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达。
目前已构建应用的基因工程载体按照来源不同，可以将载体分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体和人工染色体载体等类型；按照用途不同，可将载体分为克隆载体和表达载体。以下简要介绍几类常用的载体。
在基因工程操作中,根据运载的目的DNA片段大小和将来要进入的宿主的不同而选用不同的载体。
按照来源不同，可以将载体分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体和人工染色体载体等类型；按照用途不同，可将载体分为克隆载体和表达载体。以下简要介绍几类常用的载体。
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3.质粒载体
质粒（Plasmid）是某些细胞中独立于染色体以外的共价闭环的小分子双链DNA，它具有独立的复制能力，并可在细胞分裂中与染色体一道分配到子细胞中。不同质粒的分子质量大小不同，大的可达数百千碱基对(kb)，小的只有2-3kb。
质粒广泛存在于细菌之中,在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。质粒DNA的特点如下: (1 ) 双链环状; (2 ) 相对分子质量很小; (3 ) 自主或半自主复制; (4 ) 不同生物质粒中的基因种类不同。
细菌质粒为F因子、R因子、大肠杆菌素因子。
酵母质粒为2μ质粒、3μ质粒。
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理论上讲,所有细菌株系都含有质粒。有些质粒携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息,即F质粒。有些则表达对一种抗生素的抗性,即R质粒。还有一些携带的是参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因,即降解质粒，这为重组子的选择提供极大便利。
每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列,它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。质粒的复制和遗传独立于染色体,但其复制和转录依赖于宿主所编码的蛋白质和酶。
质粒按其复制方式分为松弛型质粒（Relaxed plasmid）（自主复制成数千个拷贝）和严紧型质粒(Stringent plasmid) （不能自主复制，仅数个拷贝）。前者的复制不需要质粒编码的功能蛋白,其复制完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶(如DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ, 依赖于DNA和 RNA聚合酶等)来进行。因此在一定的情况下,即使蛋白质的合成并非正在进行,质粒的复制依然进行。当在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时,其拷贝数可达2000～3000个。后者的复制则要求同时表达一个由质粒编码的蛋白质。
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利用松弛型质粒组建的载体称做松弛型载体(如pBR322 ),而利用严紧型质粒组建的载体叫严紧型载体(如由pSC 101为基础组建的载体)。
基因工程中大多数使用松弛型载体。
没有经过修饰的自然状态的质粒，通常缺乏高质量的克隆载体所必须的一些特性。如：不能太大，当质粒大于15kb时，其携带外源DNA转入大肠杆菌的效率就大大降低。早期以天然质粒作为裁体，现在使用的均为改造过的人工质粒，常用的有：pBR322、pUC18/19及pGEM等多种系列的质粒载体。质粒载体不仅可以用于细菌，也可以用于酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞等，既可用于目的基因的克隆，也可用于目的基因的表达。
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1)质粒载体 pBR322
pBR322是人们研究最多、使用最广泛的一种经典代表质粒载体, 至今仍广泛应用,它具备一个好载体的所有特征,其图谱结构如图5-23所示。
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通常用一个小写字母p来代表质粒,而用一些英文缩写或数字来对这个质粒进行描述。
以pBR 322为例,BR代表研究出这个质粒的研究者Bolivar和Rogigerus, 322是与这两个科学家有关的数字编号。
pBR322大小为4.36kb,由3个天然质粒的不同部分人工拼接而成的环状双链DNA分子,有一个复制起点、一个抗氨苄青霉素基因、一个抗四环素基因、多种限制酶切点,可容纳 5kb左右外源DNA。 pBR 322 上有36个单一的限制性内切酶位点, 其中包括 EocRⅠ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Sal Ⅰ、PstⅠ、PvuⅡ等常用酶位点。而 BamHⅠ、SalⅠ和 PstⅠ分别处于四环素和氨苄青霉素抗性基因上,pBR 322带有一个复制起始位点,它可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能。
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这个质粒的最方便之处是当将外源DNA片段在BamHⅠ、SalⅠ和 PstⅠ位点插入时,可用引起抗生素基因的失活来筛选重组体。如一个外源 DNA片段插入到BamHⅠ位点时,由于外源 DNA片段的插入使四环素抗性基因( Tet )失活, 可以通过 Ampr Tets来筛选重组体。利用氨苄青霉素和四环素这样的抗性基因既经济又方便。
将纯化的 pBR322分子用一种位于抗生素抗性基因中的限制性内切酶酶解,产生一个 单一的线性具粘性末端的DNA分子,把这些线性分子与用同样的限制性内切酶酶解的目的 DNA混合,在ATP存在的情况下, 用T4 DNA连接酶处理,产生一些不同连接的混合产物,包括质粒自身环化的分子。要减少这种不必要连接产物,切开的质粒可以用碱性磷酸酯酶处理,除去质粒末端的5′磷酸基团,T4 DNA连接酶不能把两个末端都没有磷酸基团的线状质粒DNA连接起来。目的DNA带有磷酸基团,它与碱性磷酸酶处理过的质粒DNA混合连接后,T4 DNA连接酶形成的两个磷酸二酯键使这两个分子连接在一起,如图5-24所示。
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在这个重组分子上还有两个切口, 转化以后这些切口就会由宿主细胞DNA连接酶系修复。
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2)质粒载体 pUC 18/19
这对载体由2.686kb组成,带有pBR322的复制起始位点,一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因(lacZ′)的调节片段,一个调节lacZ′基因表达的阻遏蛋白( Repressor)的基因lacⅠ,还有多个单克隆位点, pUC 19 的结构如图5-25所示。
由于pUC 质粒含有Ampr 抗性基因,可以通过颜色反应和Ampr对转化体进行双重筛选。
除pBR 322和pUC系列质粒以外,还有许多其他克隆载体。从原理上讲,这些载体都能满足DNA重组技术所需要的两大基本要素:一是克隆位点的可选择性;二是鉴定插入DNA重组质粒方法的简单性。
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4.λ噬菌体载体
λ噬菌体的生活周期包括溶菌周期和溶原周期：当λ噬菌体侵入大肠杆菌后，可以在细菌内扩增，并使细胞裂解，释放出大量的噬菌体颗粒；也可通过溶原途径，使其DNA整合到大肠杆菌的染色体上，以前噬菌体的形式潜伏下来。在某些特定条件下，整合的λ噬菌体被切割下来，进入裂解周期，如图5-26所示。
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λ噬菌体的基因组DNA长约48kb，在宿主体外与蛋白质结合包装为含有双链线状DNA分子的颗粒。由于受到包装效率的限制，其连接目的基因后的总长度应为λ噬菌体基因组总长度的75％-105％，超过这一范围，重组噬菌体的活力会大大降低。
λ噬菌体因野生型内含限制酶切点多而常用改造后的变种。charon系列有插入和替换型两种,带有来自大肠杆菌的β-半乳糖苷基因lacZ。M13 噬菌体含单链环状 DNA ,改造后的M13 mp8,加入了大肠杆菌的lac操纵子,常用于核酸测序。
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λ噬菌体之所以可作为构建基因克隆载体的材料,是因为它有以下几方面的特性:
1) λ噬菌体含有线性双链DNA分子,其长度为48 kb,两端各有由12个核苷酸组成的5′端凸出的互补粘性末端( cohesive end, cos),当λDNA进入宿主细胞后,互补粘性末端连接成为环状DNA分子。连接处称为cos位点(图5-27) 。
2)λ噬菌体为温和噬菌体,λDNA可以整合到宿主细胞染色体DNA上, 以溶原状态存在,随染色体的复制而复制。
3) λ噬菌体能包装λDNA长度的75%～105%,约38～54 kb,即使不对λDNA进行改造,也允许承载5 kb大小的外源DNA片段带入受体细胞。
4)λDNA上的D基因和E基因对噬菌体的包装起决定性作用, 缺任何一种基因都将导致噬菌体不能包装。在宿主(受体)细胞中积累大量供包装用的其他壳蛋白。
5)λDNA分子上有多种限制性内切酶的识别序列, 便于用这些酶切割产生外源DNA片段的插入和置换。但是有的酶在λDNA上有多个识别序列, 有的识别序列位于必需基因区域,将影响外源DNA片段的插入和置换。
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构建λ噬菌体载体的基本途径如下:
1)抹去某种限制性内切酶在λDNA子上的一些识别序列,只在非必需区保留1～2个识别序列。若保留1个识别序列,可供外源DNA插入,若保留2个识别序列,则2个识别序列之间的区域可被外源DNA片段置换。
2)用合适的限制性内切酶切去部分非必需区,但是由此构建的λDNA载体不应小于38 kb。
3)在λDNA分子合适区域插入可供选择的标记基因。根据以上策略,可以构建一系列利用不同限制性内切酶识别序列作为克隆位点的λ噬菌体克隆载体。
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值得指出的是,没有适用于克隆所有DNA片段的万能λ噬菌体载体。因此,必须根据实验需要选择合适的载体。在选择时应考虑:
①所要用的限制性内切酶;
②将要插入的外源DNA的大小;
③载体是否需要在E.coli中表达所要克隆的DNA;
④筛选方法等。
根据克隆的方式不同，λ噬菌体载体可以分为插入型载体和取代(置换)型载体两类：插入型载体适合克隆6-8kb大小的DNA片段，常用于cDNA的克隆或cDNA文库的构建，如：λgt10、λgtll等；置换型载体可以允许插入长度达30 kb的外派DNA片段，因而适用于基因组DNA的克隆及基因组DNA文库和cDNA文库的构建，典型代表为EMBL系列和Charon系列载体。
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5.人工载体
用于真核生物宿主的人工载体大多具有大肠杆菌质粒的抗药性和噬菌体强感染力,同 时满足携带真核生物的目的基因大片段DNA。如柯斯质粒是将λ噬菌体的粘性末端( cos位点序列)和大肠杆菌质粒的抗氨苄青霉素和抗四环素基因相连而获得的人工载体, 含一个 复制起点、一个或多个限制酶位点、一个 cos 片段和抗药基因,能加入40～50 kb的外源 DNA ,常用于构建真核生物基因组文库。
柯斯质粒载体(Cosmid vector)又称粘质粒载体, 是将质粒(plasmid)和λ噬菌体DNA包装有关的区段( cos 序列)相结合构建而成的克隆载体。
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这种由带cos位点的λDNA片段与质粒构建的载体既可以按质粒载体的性质转化受体 菌,并在其中复制, 又可以按λ噬菌体性质, 进行体外包装转导受体细胞。通过 cos 位点连 接环化后,按质粒复制的方式进行复制。一般构建的cosmid 载体小于20 kb,可承载 30 kb左右的外源 DNA片段,这种载体常用于构建真核生物基因组文库,它综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点。用柯斯质粒载体克隆大片段DNA的过程如图5-28所示。
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6.人工染色体载体
以λ噬菌体为基础构建的载体能装载的外源DNA片段只有24 kb左右,而柯斯质粒载体也只能容纳35～45 kb, 然而许多基因过于庞大而不能作为单一片段克隆于这些载体中,特别是开展人类基因组、水稻基因组工程的工作要容纳更长DNA片段的载体。这就使人们开始组建一系列的人工染色体。
由于酵母2μ质粒在使用过程中的局限性,人们构建了多种质粒。
整合质粒(YIP) 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段组成,可与受体或宿主的染色体DNA 同源重组,整合进入宿主染色体中,故只能以单拷贝方式存在,常用于遗传分析。
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复制型载体(YRP) 同样由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段组成,但酵母DNA片段不仅提供抗性基因筛选标志,而且带有酵母的自主复制顺序( ARS)。由于大肠杆菌质粒本身也有一个复制点,所以这类质粒既可在大肠杆菌, 又可在酵母中复制和存在, 故称为穿梭载体。通过穿梭载体,人们可首先在大肠杆菌细胞中大量扩增真核基因,然后再转入酵母中进行表达。
附加体型载体( YEP)由大肠杆菌质粒、2μ酵母质粒和酵母染色体的选择标记构成。由于 2μ质粒内含自主复制起点(ori)和使质粒在酵母细胞中稳定存在的STB区,所以这类载体在酵母细胞中独立存在。
上述三种类型的人工质粒都含有酵母细胞染色体DNA片段,相当于一条酵母人工染色体( YAC) ,但整合型的质粒进入宿主后并不单独存在。原核生物宿主的载体都是单独存在的。
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(1) YAC (酵母人工染色体,Yeast artificial chromosome )
YAC 是在酵母细胞中克隆外源DNA大片段克隆体系,由酵母染色体中分离出来的 DNA复制起始序列、着丝点、端粒以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体(图5-29 )。
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真核生物染色体有几个部分最为关键: a)着丝点 (Centromere, CEN) 它主管染色体在细胞分裂过程中正确地分配到各子细胞中;b)端粒(Telomere,TEL) 它位于染色体的末端,对于染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶切断具有重要的意义;c)自主复制序列(Autonomously replicating sequence,ARS)即在染色体上多处DNA复制起始的位点,与质粒的复制起始位点有些类似。
实际上YAC载体是以质粒的形式出现的, 这就是为什么可以看到pYAC 这个名称的原因。当用于克隆时,先要用酶进行酶解,形成真正意义上的人工染色体(见图5-30 )。
实验结果表明:每个YAC可以装进100万碱基以上的DNA片段,比柯斯质粒的装载能力要大得多。YAC既可以保证基因结构的完整性,又可以大大减小核基因库所需的克隆数目,从而使文库的操作难度减少。
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（2） BAC (细菌人工染色体, Bacteriala rtificial chromosome)
BAC 是以细菌F因子(细菌的性质粒)为基础组建的细菌克隆体系。其特点为: 拷贝数低,稳定,比YAC易分离,其对外源DNA的包容量可达300 kb。BAC可以通过电穿孔导入细菌细胞,其不足之处是对无选择性标记的DNA的产率很低。
（3）PACs( P1-derived artificial chromosomes)
PACs 是将BAC和P1噬菌体克隆体系( P1-clone) 的优点结合起来产生的克隆体系,可以包含100～300 kb的外源DNA片段。
载体的选择应根据实验的需要。克隆载体的选择较容易，选择的余地大，只要注意插入片段的大小与酶切位点相匹配即可；表达载体的选择则比较复杂，可以根据表达宿主种类及后期对表达产物的要求进行选择。
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