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基因工程的操作,是分子水平上的操作,它依赖于一些重要的酶作为工具来对基因进行 人工切割和拼接等操作。
基因工程的关键技术是DNA的连接重组。在DNA连接之前必须进行加工, 把DNA分子切割成所需片段,有时为便于DNA片段之间的连接, 还须对DNA片段末端进行修饰。 一般把DNA分子切割、DNA片段修饰和DNA片段连接等所需的酶称为工具酶。
基因工程涉及的工具酶种类繁多、功能各异, 就其用途可分为三大类:
(1 ) 限制性内切酶
(2 ) 连接酶
(3 ) 修饰酶
几种重要的工具酶的酶学性质及用途列于表5-10。
5.3.4基因工程工具酶
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1.限制性核酸内切酶
(1)定义
识别和切割dsDNA分子内特殊核苷酸顺序的一类核酸酶统称为限制性内切酶,简称限制酶 (Restriction endonedeases)。限制性内切酶与甲基化酶共同构成细菌的限制—修饰体系，其功能为限制(切割)外源DNA和保护自身DNA，维持细菌自身遗传性状的稳定。
(2) 命名
对于限制性内切酶的命名, H.O.Smith和D. Natnans提出的命名规则已为广大学者所接受。其命名原则为:根据分离出此酶的微生物的学名进行命名, 一般取三个字母, 即微生物属名前的第一个字母大写,种名的前两个字母小写。如果该微生物有不同的变种和品系,则后接变种和品系的第一个字母。从一种微生物细胞中发现几种限制性内切酶, 则根据发现和分离的顺序用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等罗马数字表示。
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如从Haemophilus in fluenzae D株分离到的两种限制性内切酶分别命名为Hind, HindⅡ。从 Escherichia coli R 株分离到的第一种限制性内切酶命名为EcoRⅠ。从Bacillus amylolique f acies H株分离到的两种限制性内切酶分别命名为BamHⅠ、BamHⅡ等。
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(3 ) 分类
从原核生物中已发现了约400种限制酶,常用的有几十种, 可分为3类。三类不同的限制性核酸内切酶具有不同的特性(表5-11 )。
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（1）Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶
Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于ATP的限制性内切酶的活性。Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA,然后从底物上解离下来。Ⅰ类酶结合于特定的识别位点,但却没有特定的切割位点,酶对其识别位点进行随机切割,很难形成稳定的、 特异性切割末端。
所以,Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶在基因工程中基本不用。
（2）Ⅱ类限制性内切酶
Ⅱ类限制性内切酶有如下特点: a)识别特定的核苷酸序列,其长度一般为4, 5, 6个核苷酸且呈二重对称;b)具有特定的酶切位点,即限制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割,由此产生特定的酶切末端。
所以,Ⅱ类限制性内切酶是基因工程中使用的主要工具酶。
限制性内切酶在基因工程中的主要用处是通过切割DNA分子,对含有的特定基因片段进行分离、分析。几乎所有的在基因工程中使用的限制性内切酶都已商品化。查阅各公司的样本手册,就可以找到各种酶反应条件。
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（4） 限制性内切酶的性质
从应用上看,限制性内切酶的专一性很重要,下面介绍它对碱基的特异性及切断双链 DNA的方式。
1）识别序列
限制性内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列称为识别序列或识别位点。
限制性内切酶对碱基序列有严格的专一性,这就是它识别碱基序列的能力,被识别的碱 基序列通常具有双轴对称性,即回文序列 ( Palindromic sequence )。例如EcoRⅠ的识别序列如图 5-31 所示
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一些限制性内切酶的识别位点见表5-12。
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2）切割位点
限制性内切酶对双链DNA分子的作用是切割磷酸二酯链,它仅水解3′酯键, 产生3′羟基、5′磷酸基的片段。
Ⅱ类限制性内切酶的切割位点处在识别序列区内, DNA分子两条链断开后产生的末端 因所用的酶不同而不同。一类是两条链交错对称断开,产生的 DNA末端的一条链多出一至几个核苷酸,成为突出末端,又称粘性末端。另一类则是在切割两条链时产生两端平整的DNA分子,称为平末端。
限制性内切酶切割DNA的位点和切割片段的末端如图5-32 所示。
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经限制性内切酶切割产生的DNA分子片段,不管是粘性末端,还是平末端, 5′端一定是磷酸基团,3′端一定是羟基基团。
有一些限制性内切酶虽来源不同, 但有相同的识别序列,称为同裂酶 (Isoschizomer )。 如BamH I 和Bst I具有相同的识别序列GGATCC。
有些限制性内切酶虽识别序列不同,但切割DNA分子产生的限制性片段具有相同的粘性末端,这样的酶称为同尾酶(Isocaudamer)。如TaqⅠ、ClaⅠ和Acc Ⅰ为一组同尾酶, 其中任何一种酶切割DNA分子都产生5′端CG凸出的粘性末端。
同尾酶在DNA片段重组时特别有用。
限制性内切酶的识别位点在DNA分子中出现的频率不同,识别位点序列短的限制性内切酶就会更频繁地切割DNA分子。
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经限制酶切割后产生的DNA片段称为限制性片段,不同限制酶切割DNA后所形成的限制性片段长度不同。设A或T在DNA分子中出现的频率为x, G或C出现的频率为y,则限制酶在该DNA分子上切割频率(或位点频率)F可用下式表示:
一个切割位点 即限制性片段平均长度分别为256 个和4096 个碱基对。
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2.连接酶
用于将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶称为连接酶(Ligase)。
基因工程中最常用的DNA连接酶有两种，一种是T4DNA连接酶(T4DNA Ligase)，是从噬菌体T4感染的大肠杆菌中分离纯化获得的，它催化DNA 5′磷酸基与3′羟基之间形成磷酸二酯键。另一种是大扬杆菌DNA连接酶(E.coli DNA Ligase)，是直接从大肠杆菌中分离纯化的连接酶，其催化反应基本与T4 DNA连接酶相同,只是催化反应需要辅助因子NAD+参与。
这两种连接酶催化连接反应的机制是类似的，都能把双链DNA中1条单链上相邻两核苷酸断开的磷酸二酯键(称之为切口)重新闭合。两种连接酶催化的反应过程，在两个方面有不同，一方面是T4DNA连接酶可以催化平头末端的双链DNA链间的连接，也能催化粘性末端的双链DNA的连接。而大肠杆菌DNA连接酶对平头末端的双链DNA连接的催化效率极低，因此它一般使用于粘性末端连接。另一方面是，T4DNA连接酶催化的反应需要能量因子ATP参与，而大肠杆菌DNA连接酶需NAD辅因子。所以，T4DNA连接酶较大肠杆菌DNA连接酶更为常用。
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3.基因工程中的修饰酶
（1）DNA 聚合酶 ( DNA polymerase )
DNA聚合酶催化以DNA为模板合成DNA的反应，在基因工程技术中用于DNA的体外合成。目前常用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KIenow酶)、T4DNA聚合酶及耐高温DNA聚合酶以及耐高温DNA聚合酶(如 Taq DNA聚合酶)等。这些DNA聚合酶的共同特点是，它们都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3＇-羟基末端上。
1）大肠杆菌DNA聚合酶I
该酶具有3种活性：5＇→3＇聚合酶活性、5＇→3＇外切酶活性及3＇→5＇外切酶活性。它在分子克隆中主要用于制备供核酸分子杂交用的放射性同位素标记的DNA探针。
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2）K1enow聚合酶
是由大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)经枯草杆菌蛋白酶处理后产生出来的大片段分子。Klenow聚合酶仍具有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性，但是失去了5＇→3＇外切酶活性，主要用于填补经限制酶消化所形成的DNA 3＇-末端、合成cDNA的第二链及DNA序列的测定。
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3）热稳定DNA聚合酶
TaqDNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子质量为65ku，最佳反应温度为70℃。TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链反应(pCR)。
不同来源的DNA 聚合酶具有各自的酶学特性。
耐高温的DNA聚合酶(如Taq)由于其最佳作用温度为75～80℃, 目前广泛用于聚合酶链式反应( Polymer ase chain r eaction, 简称PCR)及DNA测序。
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无论哪种DNA聚合酶,其催化的反应均为使两个DNA片段末端之间的磷酸基团和羟基基团连接形成磷酸二酯键。
当存在单链DNA模板及带3′羟基的引物时,其反应可表示为
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(2) 逆转录酶
逆转录酶又称反转录酶,是一种有效的转录RNA产生cDNA的酶。产物DNA称cDNA,即互补DNA (Complementary DNA),该酶又称为依赖于RNA的DNA聚合酶 (RNA-dependent DNA polymer ase),它具有5＇→3＇聚合酶活性和5＇→3＇外切酶活性。
逆转录酶在基因工程中的主要用途是以真核mRNA为模板,合成cDNA , 用以组建cDNA 文库以进而分离为特定蛋白质编码的基因。近年来将逆转录与PCR偶联建立起来的逆转PCR ( RT-PCR)使真核基因的分离更加有效。
目前，已经从许多种RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，但最普便使用的则是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)中的反转录酶。在体外以mRNA模扳合成cDNA，是反转录酶的最主要用途。
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(3)T4 多核苷酸酶
T4多核苷酸酶催化ATP的 γ-磷酸基团转移至DNA或RNA片段的5′末端。在基因工程中主要用于: a ) 标记 DNA片段的5′端,制备杂交探针;b ) 基因化学合成中,寡核苷酸片段5′磷酸化; c ) 用于测序引物的5′磷酸标记
（4） 碱性磷酸酶
目前采用的碱性磷酸酶有两种,即来源于大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶(BAP)和来源于牛小肠的牛小肠碱性磷酸酶(CIP)。CIP的比活性比BAP高出10倍以上,而且对热敏感,便于加热使其失活。
碱性磷酸酶的功能是将DNA或RNA 5′末端的磷酸基团变为羟基,反应表示如下:
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碱性磷酸酶可用于: a) 去除 DNA片段中的5′磷酸, 以防止在重组中的自身环化,提高重组效率,如图5-34; b ) 在用[γ-32 P] ATP标记DNA或RNA的5′磷酸前,去除DNA或 RNA片段的非标记5′磷酸。
除上面介绍的一些工具酶外,还有一些工具酶在基因工程的操作中被广泛应用,如核酸 酶BAL31、脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DnaseⅠ)、外切核酸酶Ⅲ等,这些核酸酶可用于核酸分子的修饰或降解。
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2.3.5重组体的构建
将目的基因或序列插入载体，并连接成为重组体，主要依靠双链DNA黏性末端单链序列的互补结合和DNA连接酶的作用，主要有以下几种方式。
⑴相同酶切位点的连接
如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的黏性末端在降低温度(退火)时，能重新配对，在DNA连接酶的催化下，形成3＇，5＇－磷酸二酯链，将两端点连接起来，构成重组体分子，如图5-35 所示。
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（2）不同限制酶产生相同黏性末端的连接
不同的限制性核酸内切酶消化，如果产生的DNA的黏性末端相同，也同样可用上述方法连接，如：上述识别6bp序列的BamHI和另一识别4bp序列的Sau3AI，切割DNA后都产生5-突出黏性末端GATC，可以互补结合连接，如图5-36所示。
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（3）平末端连接
T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用，用不同的限制性内切酶切割后的黏性末端不能互补结合，则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端，再用T4DNA连接酶连接，但平末端连接要比黏性末端连接的效率低得多。。
（4）同聚物加尾连接
如果要连接的两个DNA片段没有能互补的黏性末端，可用末端转移酶催化，在DNA的3＇－末端添加一段同聚物序列，例如:一段DNA加上polyG，另一段DNA(载体)加上polyC，这样人工地在DNA两端制造出能互补的共核苷酸多聚物黏性末端，退火后能结合连接，这种方法称为同聚物加层法。
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（5）人工接头连接
对平末端的DNA或载体DNA，也可先连上人工设计合成的脱氧寡核苷酸双链接头，使DNA末端产生新的限制内切酶位点，经内切酶切割后，即可按黏性末端相连。
上述连接方法中以互补黏性末端的连接效率最高，应用最广。当缺乏合适的黏性末端酶切位点可以利用时，就不得不采用平端限制性内切配制备载体和目的基因片段。平末端连接效率低，并有多拷贝插入及双向插入等缺陷，因此应用受到限制。
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