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5.3.8 DNA 序列分析
DNA序列分析是指通过一定的方法确定DNA上的核苷酸排列顺序,是基因工程中的重要技术之一,在基因的表达、结构与功能的研究中是必不可少的。
DNA序列分析技术(DNA sequence analysis technology)极大地促进了基因的分离与鉴定、基因的表达调控及基因的结构与 功能的研究。DNA序列分析已从手工操作发展到自动分析。
DNA 序列分析主要由以下三部分组成:
a)具有不同长度的 DNA片段的产生和标记;
b) 聚丙烯酰胺凝胶电泳;
c) DNA序列的显示,即测序胶放射自显影或在自动测序仪上通过自动记录荧光信号读取DNA序列。
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1.Maxam-Gilbert化学降解法
1977年, 由Maxam-Gilbert提出此法,其原理是先用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基,然后用哌啶切断多核苷酸链。
利用四组不同的特异反应,可以将末端(3′端或5′端) 用放射性标记的DNA分子降解,形成不同长度的寡核苷酸,这些寡核苷酸的长度相当于从特异反应引起的切点到标记末端之间的DNA 长度。可以通过凝胶电泳将每组反应中不同长度的寡核苷酸分离开来,对照四组不同的反应所产生的电泳带的位置,即可读出所测定的DNA序列。
(1)四组特异反应分别如下:
1)G反应 用硫酸二甲酯处理DNA,使鸟嘌呤上的N7质子甲基化。甲基化的鸟嘌呤与脱氧戊糖之间的键在中性环境中加热断裂,鸟嘌呤碱基脱落,多核苷酸骨架在鸟嘌呤处发生断裂,如图5-42 ( a )所示。
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第5章现代环境生物技术原理
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2)G + A反应 用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化,从而使其糖苷键变得不稳定,再用哌啶使嘌呤脱落。
3)T + C反应 用肼使T和C的嘧啶环断裂,再用哌啶除去碱基。
4)C反应 当有NaCl存在时,肼只与C发生反应,不与T反应,断裂的C可用哌啶除去。
哌啶也可在经过化学修饰的位点使DNA的糖-磷酸链断裂。
Maxam-Gilbert 化学降解法（Chemical degradation）所用的修饰技术列于表5-13。
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(2)Maxam-Gilbert化学降解法的过程
1)用限制性内切酶将DNA切成大约250bp的片段;
2)用碱性磷酸酶除去DNA片段5′段的磷酸基;
3)用T4多核苷酸激酶和(γ32P)ATP ,使DNA片段5′段带上同位素标记;
4)用聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis）纯化待测DNA片段,经碱变性后,回收其中的一条单链,分别进行上述四组不同反应。
5)反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后放射自显影,从X线片上读出DNA序列,如图5-42 ( b)所示。
该法的优点是准确可靠,较易掌握,至今仍是常用的测序方法。其缺点是一轮反应所能测定的长度只有250bp。若测定大片段时,非常麻烦。因此,目前采用更多的是较简单快速的 Sanger双脱氧法。
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2. Sanger双脱氧法
1977年,由Sange建立此法,其原理是:利用2′, 3′-双脱氧三磷酸核苷酸(2′, 3′- ddNTP)来终止DNA复制反应。2′, 3′-ddNTP与dNTP的不同之处在于它们在脱氧核糖的3′位置缺少一个羟基(图5-43 )。
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它们可在 DNA聚合酶作用下通过其5′磷酸基掺入到真正延伸的DNA链中。由于缺少3′羟基,不能与后续的dNTP形成磷酸二酯键,因此, DNA链的合成被终止(见图5-44 )。从原理上讲, Sanger法是开创性的。
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Sanger法所用的试剂有:
1) 模板:测序的模板即含有被测序列的DNA分子。模板的质量与数量同测序结果密 切相关,模板同引物的比例一般采用摩尔比1∶2为宜。
2) 引物: 利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物,引 物一般长15～29个核苷酸,可视具体情况而定。
3) DNA 聚合酶: 较广泛采用的测序酶是T7DNA聚合酶。
4) 放射性标记的dNTP: 一般采用[α-32P]的dNTP和dCTP。
5) 利用dNTP 类似物防止在二重对称的 DNA区段 (特别是GC含量高者 )形成链内 二级结构,在电泳过程中不能充分变性。这类 dNTP类似物有dNTP(2′-脱氧次黄苷-5′-三磷酸)、7-脱氧-dGTP等。
这些试剂都可以从各试剂公司买到,并附有详细的操作说明。Sanger双脱氧测序法如图5-45所示。
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DNA序列分析技术（DNA Sequence analysis technology）的发展,为人类最终解译人类基因组序列开辟了道路,目前这一技术已从手工操作发展到全自动化操作。
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5.3.9 外源基因在宿主中的表达
将克隆的外源基因(Exogenous gene)转入宿主细胞(Host cell)，最终是为了让外源基因获得表达，产生出相应的编码蛋白(Encoded protein)。要实现此目的，外源基因必须在调节元件控制下进行转录和表达。基因表达涉及到转录(Transcription)和转译(Translation)两个方面。外源DNA首先要转录出mRNA，然后在核糖体上进行蛋白质的合成，以获得酶、结构蛋白、激素、抗体等各种各样的功能蛋白。在许多条件下，新生的多肽需要经过转译后的加工和修饰，才能成为有功能的活性蛋。真核和原核细胞在转录的起始与终止，转译前及转译后的加工过程都有很大的区别。
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1.外源基因在原核细胞中的表达
大肠杆菌是最早采用的原核表达体系(Prokaryotic expression system)，其优点是：宿主遗传背景清楚，培养简单，迅速适应大规模生产；主要缺点是：缺乏适当的翻译后加工机制，真核细胞来源的蛋白质不能进行糖基化修饰，产物常形成不溶性的包涵体。包涵体是外源蛋白与周围杂蛋白或核酸等形成的不溶性聚合体，后续纯化很困难。
影响外源基因表达的因素包括：载体中启动于的强弱、RNA的翻译效率、密码子的选择、码子的选择、表达产物的大小、表达方式以及表达产物的稳定性等。
蛋白质的表达方式有分泌表达、非分泌表达、融合表达和非融合表达等。在实际工作中，要针对相应的外源基因设计相应的表达策略，这里仅介绍一种目前常用的融合蛋白的表达。
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融合表达(Fusion expression)是指将外源目的基因与另一基因构建成融合基因进行表达。融合蛋白由氨基端的原核蛋白、能被蛋白酶等裂解的肽序列以及目的蛋白组成。该表达方式较易获得高效表达,而且融合蛋白通常较天然的外源蛋白稳定，下游纯化也较为方使。融合表达也有一些缺点，有时会在目的蛋白中引入其他氨基酸。近年来，发展出了多种新的融合蛋白表达系统，这些系统常利用一些特殊的短肽(如：6个组氨酸的短肽)或者一些特殊的多肽（如：谷胱甘肽巯基转移酶，GST)作为融合蛋白的一部分。因为6个组氨酸短肽可以和带有镍离子的琼脂糖珠结合，GST可以与偶联有谷胱甘肽的琼脂糖珠结合，所以可以通过亲和层吸技术纯化表达的融合蛋白。
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2.外源基因在真核细胞中的表达
依宿主细胞的不同，真核表达系统可分为酵母、昆虫以及哺乳类动物细胞表达系统等。这些表达系统在重组DNA药物。疫苗生产及其他生物制剂的生产上都获得了一些成功，另外在研究各种蛋白质分子在细胞中的功能方面也得到了非常广泛的应用。
利用真核细胞表达外源基因主要有两方面的目的：
a)研究该基因在细胞中的作用和机制；
b)获得足够量的纯化目的蛋白，用于治疗、诊断及结构研究。前者对表达系统的要求较低，只要宿主细胞适合、表达载体相配及载体对细胞功能无影响即可。如果外源蛋白对细胞有毒性，还可以选用诱导型表达载体。后者对表达系统要求较高，要获得足够量的、纯化的目的蛋白，则需要仔细选择表达系统。
哺乳动物细胞无疑是最理想的表达人类基因的系统，应为首选。人源性蛋白在哺乳动物细胞中可以获得与人类最接近的转录和翻译后修饰，因而可以较为精确地折叠成天然构象，具有最理想的活性。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞就是在生物技术中应用最广泛的细胞之一。用哺乳动物细胞进行蛋白表达的主要缺点是：表达水平不尽理想，且生产成本高。
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酵母是单细胞真菌，也是比较成熟的工业用微生物，由于其易培养、无毒害且生物学特性研究得比较清楚，因此很适合作为基因工程菌。酵母表达系统同时兼有大肠杆菌的表达水平高、易培养、成本低和真核细胞的可以较好折叠及修饰的优点。Pichia Pastoris是目前较常用的一种酵母茵，用该系统表达外源基因，其最高表达水平可以达到12g/L。到目前为止，许多酶、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、受体、单链抗体及调节蛋白都在该系统中进行了成功表达。
利用昆虫病毒表达载体与培养的昆虫细胞形成的表达系统是另一种具有较高表达能力的表达系统，也是一种较有发展前景的真核表达系统。
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5.3.9基因工程在环境污染治理中的应用
随着工业发展，大量的合成有机化合物进人环境，其中很大部分难于生物降解或降解缓慢，如多氯联苯、多氯烃类化合物，其水溶性差，难生物降解，致使在环境中的持留时间长达数年至数十年。
基因工程为改变细胞内的关键酶或酶系统提供了可能，从而可以：
①提高微生物的降解速率；
②拓宽底物的专一性范围；
③维持低浓度下的代谢活胜；
④改善有机污染物降解过程中的生物催化稳定性等
利用对不同底物具有降解活性的酶的组合构建新的复合代谢途径，已应用于卤代芳烃、烷基苯乙酸等的降解。通过引入编码新酶的活性基因，或对现有的基因物质进行改造、重组，构建新的微生物，可用于氯代芳烃混合物的降解。
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1.设计复合代谢途径
硝基芳香族化合物，如炸药，即2,4,6 三硝基甲苯（简称TNT)，由于苯环上有强的吸电子基团（-NO2)，因此难以好氧生物降解，有关TNT作为微生物惟一碳源的报道极少，并且硝基脱除后形成的甲苯或其他芳香族衍生物难于进一步降解。
一株假单胞菌（Pseudomonoas )，可以利用TNT作为惟一氮源，但形成的代谢产物甲苯、氮基甲苯和硝基甲苯不能被进一步降解。因为该微生物不能利用甲苯为碳源生长。将具有甲苯完整降解途径的TOL质粒pWWO-Km 导入该微生物，可以扩展微生物的代谢能力，构建的微生物可以利用TNT为惟一碳源和氮源生长，尽管TNT能被这种复合降解途径所代谢，但由于硝基甲苯还原形成的氨基甲苯仍然难以被降解。对该微生物进一步修饰，构建新的微生物消除其硝酸盐还原反应，可以使TNT完全降解。
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2.拓宽氧化酶的专一性
许多有毒有害有机物，如芳香烃、多氯联苯（PCBs）、氯代烃等，其最初的代谢反应大多由多组分氧合酶催化进行。这些关键酶的底物专一性阻碍了一些有机物的代谢，如多氯联苯的异构体等。如何拓宽这些酶的底物范围以有效降解环境中的这类物质，是环境生物技术领域研究的一个重要方面。
对于多氯联苯-联苯降解菌(Pseudomonoas Pseudoalcaligenes)和甲苯-苯降解菌Pseudomonoas putida F1，其最初双氧合酶编码基因的遗传结构、大小和同源性是相似的。然而，Pseudomonoas Pseudoalcaligenes不能氧化甲苯，而Pseudomonoas putida F1不能利用联苯为碳源生长。将两种双氧合酶不同组分的编码基因“混合”，可以构建复合酶体系，以拓宽其底物专一性（如图5-46a,b）。
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将编码终端甲苯双氧合酶组分的基因，todC1和todC2导入Pseudomonoas Pseudoalcaligenes［图5-46 (c）］，可以构建重组菌株，使其能够氧化甲苯并利用其作为生长底物甲苯双氧合酶活胜必需的组分铁氧化还原蛋白（FD）及其还原酶，显然可由宿主细胞中的联苯双氧合酶组分提供
用甲苯双氧合酶中的类似基因代替联苯双氧合酶中的终端铁硫蛋白的亚单元编码基与建杂合多组分双氧合酶［图5-46 (d)］。这些新的杂合酶既可以氧化甲苯，又可以氧化联苯。由此可以看出，通过取代相关酶中的一些组分，可以改变其底物的专一性。
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三氯乙烯（TCE）是一类存在广泛且难以生物降解的有机污染物，某些氧合酶可以进攻该分子，尽管氧化速率通常很低甲苯双氧合酶对TCE具有部分活性．但在催化过程中易失活。Pseudomonoas Pseudoalcaligenes中天然的联苯双氧合酶不能氧化TCE，但实验发现，构建的包含甲苯双氧合酶大氧合酶亚单元的杂合联苯双氧合酶体系可以氧化TCE，并且其氧化速率为天然甲苯双氧合酶的3倍。这是一个令人振奋、具有十分重要意义的结果，但目前未见进一步深人研究报道。如果复合酶在TCE 氧化过程中比甲苯双氧合酶更稳定，那么利用这种方法构建出新的酶系统，拓宽其底物专一性，在环境污染物降解应用方面中将大有所为。拓宽联苯双氧合酶底物专一性范围的另一应用是降解多氯联苯（PCBs）。工业用 PCBs 的混合物，如 Aroclors 有60-80种同系物。处理受多氯联苯污染的土壤时，要求微生物能降解绝大多数或所有的这些同系物。因此，如何拓宽联苯双氧合酶的底物范围，成为近期研究的热点。
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Bopp的研究表明，Pseudomonoas Sp. LB400中的联苯双氧合酶能氧化较广谱的PCBs同系物，包括一些六氯代联苯，但对一些对位取代的同系物，如 4,4'-,2，4，4'-,2,4,3',4’-氯代联苯的降解很慢。P.Pseudoalcaligenes KF7O7中的联苯双氧合酶对PCBs的作用范围较窄，但能降解对位取代的同系物。上述两种酶系统的DNA完整序列已经知道，并且两者具有很高程度的序列同源性。这些联苯双氧合酶中的两个组分是完全相同的，其他组分也显示出95％以上的等同性。
Erickson等人认为，将P.Pseudoalcaligenes KF707联苯双氧合酶的终端组分中的氨基酸引人到Pseudomonoas Sp. LB400双氧合酶终端组分中可以增加后者酶对对位取代的 PCBs的降解活性。利用定位诱变，在LB400酶终端组分中改变4个氨基酸，即将区域 335 到341中的TFNNIRI改变成KF707中的AINTIRT。当诱变质粒转入到 E.coli细胞后进行PCBs同系物专一性分析，结果发现新的酶对对位取代的PCBs具有降解活性，并同时保留了LB400联苯双氧合酶较广谱的底物范围。上述实验表明，可以通过对关键酶类的基因改造来拓宽其对底物降解的专一性范围。
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3.增强无机磷的去除
有些细菌能够以聚磷酸盐的形式过量积累磷。大肠杆菌（E.coli）中控制磷积累和聚磷酸形成的磷酸盐专一输运系统和poly P激酶由pst操纵子编码。通过对编码Poly P 激酶的基因ppk和编码用于再生ATP的乙酸激酶的基因ack A进行基因扩增，可以有效地提高E.coli对无机磷的去除能力(图5-47)。
重组体 E.coli中包含有高拷贝数的含有ack A和ppk基因的质粒，并能高水平地表达相应的酶活性，与缺乏质粒的原始菌株相比，重组体的除磷能力提高2 -3倍。实验观察到，含有 poly P激酶和乙酸激酶扩增基因的菌株除磷速率最高。该菌株可在4h内，将0.5 mmol/L的磷酸盐去除约90%，而对照菌株在相同的时间内仅去除20％左右。此结果显示，通过基因工程改进酶的活性，在无机污染物如磷的处理方面也大有潜力
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