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5.4.1 细胞工程概述
细胞工程
细胞工程（Cell engineering）是在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程, 简单地说,是应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论与技术, 按照人们的要求,有计划地大规模培养生物组织和细胞以获得生物及其产品, 或改变细胞的遗传组成以产生新的品种,为社会和人类生活提供需要的技术。
①细胞培养
②细胞融合
③细胞重组
④遗传物质转移
第5章现代环境生物技术原理
5.4微生物细胞工程
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(1)细胞培养
细胞培养（Cell culture）是将细胞从生物体内取出，然后在特制的培养容器内给予必要的生长条件，使其在体外继续生长与繁殖。
影响因素
营养：即培养
基的配方，不
同的细胞需要
不同的培养基
组分
生长环境：如温
度、 pH 等
细胞培养有动物细胞培养，植物的花粉、原生质体的培养等。
第5章现代环境生物技术原理
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促融因子
质膜发生粘连
培养
凝集现象
细胞质融合
核融合
（2）细胞融合
在一定的条件下，将两个或多个细胞融合为一个细胞的过程，细胞融合(Cell fusion)又称细胞杂交(Cell hybridization)。
动物之间、植物种间可以融合，而且动物和植物细胞之间也可以杂交。
第5章现代环境生物技术原理
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细胞重组
(Cellular reprogramming)
核移植：
借助显微操作仪，在显微镜下用微吸管把一个细胞中的细胞核吸出，直接移到另一个去核的细胞中
细胞器移植：
通过原生质体对已分离纯化的叶绿体的胞饮作用，进行叶绿体移植，或通过微注射、载体转移以及胞饮摄人进行线粒体移植
第5章现代环境生物技术原理
（3）细胞重组
在体外条件下，运用试验技术从活细胞中分离出各种细胞的结构或组件，再根据需要把它们在不同的细胞之间重新进行装配，成为具有生物活性的细胞。
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（4）遗传物质转移
遗传物质转移(Transfer of genetic material)是基因在细胞水平上的转移。
载体法：在双子叶植物如番茄、甜菜、棉花和大豆等常用载体转移基因的方法，将含有外源基因的根瘤农杆菌与受体原生质体共同培养，或将含有外源基因的质粒和受体原生质体用聚乙二醇处理转化，最后由转化体培育成转化植物。
遗传物质转移方法
第5章现代环境生物技术原理
直接导人法：最常用的是微射法，即在显微操作仪的帮助下，用微针直接对细胞进行注射，直接将外源基因注人到一个受体的受精卵的核，然后合子便能发育成胚，并进一步发育成为成熟的个体。
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第5章现代环境生物技术原理
细胞工程的发展建立在细胞融合的基础上, 人们可以根据需要, 经过科学设计, 在细胞 水平上改造生物的遗传物质。它所要求的技术条件、实验设备及试剂、经费等均比基因工程 要求的低一些。利用细胞工程技术,可以大量培养细胞组织乃至完整个体。迄今为止, 人们从基因水平、细胞器水平以及细胞水平等多层次上开展了大量研究工作, 在细胞培养、细胞融合、细胞代谢物的生产和克隆等方面取得了辉煌的成绩。
细胞工程与基因工程的关系如图5-48所示。
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可以看出，除在被转移遗传物质的水平及遗传物质的转移方法方面细胞工程与基因工 程有着明显差异外,在选择、纯化、鉴定等方面, 二者的步骤与方法基本类似, 仅仅是针对不 同的实验对象采用不同的方法而已。现在,两大技术间出现了相互渗透的趋势, 如细胞工程中利用细胞杂交方法来制备单克隆抗体;基因工程中利用单克隆抗体来选择转移基因表达的阳性物质, 极大地提高了选择的 速度与效率;细胞工程也采用提取 DNA和 RNA直接转入细胞的方法等。
第5章现代环境生物技术原理
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在生物技术中,细胞工程占据十分重要的地位, 由于其应用上的价值, 越来越受到人们 的重视。目前,细胞工程所涉及的主要技术有: 动植物组织和细胞的培养技术、细胞融合技术、细胞器移植和细胞重组技术、体外授精技术、染色体工程技术、DNA 重组技术和基因转移技术等。这些技术有些在细胞水平上,也有些在基因水平上, 它们之间是密切联系的,基因工程技术不断渗透到现代细胞工程中来,在细胞工程的研究开发中发挥着重要作用。细胞工程的主要技术及其应用如图5-49所示。
第5章现代环境生物技术原理
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5.4.2微生物细胞工程
1.微生物细胞工程概述
微生物细胞工程（Microbial cell engineering）是应用微生物进行细胞水平的研究和生产, 具体内容包括各种微生物细胞的培养、遗传性状的改造、微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等。
(1 ) 微生物的培养
包括不同微生物的营养要求以及各种微生物的培养方法, 此部分内容将在“发酵工程” 部分详细介绍。
(2 ) 遗传性状的改造
改变微生物的遗传性状, 主要是为了进行基础性遗传学研究或选育高产菌株, 前者属 “遗传学”内容。进行微生物育种的途径很多, 主要有物理或化学诱变、DNA 重组等。诱变育种将在“发酵工程”部分介绍。DNA 重组技术已在“基因工程”中有所论述。
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近年来应用很广,而且技术操作与条件要求都比较简单的微生物原生质体融合技术日 益受到人们的重视,这是本节的主要内容。
(3 ) 微生物细胞的应用
包括应用微生物细胞本身,如生产单细胞蛋白( single cell protein, SCP) ,或利用微生物 细胞进行有用产物的生产。
本节主要讨论微生物细胞原生质体融合技术,这主要有以下两方面考虑:
1 ) 原生质体融合是进行细胞遗传重组的最简便方法, 其优点很多, 特别是在不具有接 合作用的菌株之间,或对感受态尚不了解的菌株, 除去细胞壁之后, 原生质体之间可以比较 容易地进行细胞质融合,进而核融合。
2 ) 通过 DNA重组技术, 携带外源 DNA的载体,在适当的条件下可以进入受体细胞, 如 pBR 322可以较容易地进入大肠杆菌细胞中, 但对链霉菌、酵母菌、丝状真菌, 这种转化 是十分困难的。因此,消除细胞壁的原生质体是目前将重组 DNA 技术用于上述微生物的关键环节。为使重组 DNA 技术成功,受体菌原生质体的形成与再生都是十分重要的。图5-50 是微生物原生质体融合过程的示意图。
第5章现代环境生物技术原理
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在原生质体融合的基本过程中,经培养获得大量菌体细胞,用脱壁酶处理脱壁,制成原生质体。将两种不同菌株的原生质体混合在一起,使原生质体彼此接触、融合, 使融合的原生质体在合适的培养基平板上再生出细胞壁,并生长繁殖, 形成菌落, 最后测定参与融合的性状重组或产量变化情况,以筛选出重组子。
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2. 微生物细胞融合
(1)原生质体及其制备
细菌细胞外有一层成分不同、结构相异的坚韧的细胞壁, 形成了抵抗不良环境因素的天 然屏障。正是这一层坚厚的细胞壁,阻止了不同细胞间内含物的接触、混合, 从而阻止了遗传信息的重组。
为了进行细胞融合,必须先除去细胞壁。目前常用的方法是酶解法。 溶菌酶(Lysozyme )广泛存在于动植物、微生物细胞及其分泌物中, 它能特异地切开肽聚糖中 N-乙酰胞壁酸与 N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1, 4-糖苷键, 从而使革兰氏阳性菌的细胞壁溶解。但由于革兰氏阴性菌细胞壁组分与革兰氏阳性菌的差异, 处理革兰氏阴性菌时, 除了溶菌酶外,一般还需添加EDTA ,才能除去它们的细胞壁, 制得原生质体。
第5章现代环境生物技术原理
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原生质体的形成率可按下式计算:
原生质体形成率 = 原生质体数/ 未经酶处理的总菌数
根据微生物细胞壁的不同结构和组成,可采用不同的脱壁方法。各种微生物细胞的脱壁方法如表 5-14 所示。
第5章现代环境生物技术原理
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细胞壁溶解后, 原生质体即以球状体的形式开始释放, 由于原生质体对渗透压很敏感 (如图5-51) , 必须使用渗透压稳定剂维持其稳定性, 常用的渗透压稳定剂有蔗糖、KCl、NaCl 及多种糖和糖醇。
使原生质体回复到原来的细胞形状需要再生出细胞壁, 将原生质体置于高渗再生固体 培养基中,经培养后有一定比例的原生质体可再生出细胞壁。
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(2 )融合重组
细胞融合就是把两亲株的原生质体混合在一起,促进融合, 然后将融合液涂布在平板上 再生,检出重组子, 如图 5-52所示。
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(3)原生质体再生成细胞
使原生质体再生成细胞,是细胞融合的一个关键环节, 不同微生物的原生质体所要求的 再生条件不同。 再生频率的测定可利用原生质体对渗透压敏感的特性来设计, 将原生质体涂布于再生 培养基平板之前用水稀释处理,使原生质体破裂失活, 然后再涂平板, 这样长出的菌落代表 非原生质化的细胞数。未经水稀释而用高渗稳定剂进行稀释的原生质体在再生平板上长出的菌落数为原生质体和非原生质化细胞的总和。两者之差即为原生质体再生细胞数。再生 频率可按下式计算:
再生频率 = (原生质体再生细胞数/ 总菌落数)×100 %
制备不同菌株的原生质体时,其原生质化细胞的多少和再生频率的高低, 将影响融合重 组的频率。
第5章现代环境生物技术原理
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(4) 融合重组的测定
通常采用染色体标记的遗传重组体来检测, 如果两亲株的遗传标记为营养缺陷型A+B- 及A-B+ ,或抗药性标记为 SmrTcs 及 SmsTcr ,则其重组子应为原养型A+B+或双重抗性 Smr Tcr。
检出重组子的方法有:
①直接法,将融合液涂布在不补充两亲株生长所需营养物或补充两种药物的再生平板上, 直接筛 选出原养型或双重抗药性的重组子;
②间接法,将融合液涂布在营养丰富的再生平板上,使亲株和重组子都再生, 然后用印影法复制到 选择培养基上以检出重组子。融合频率可按下式计算:
融合频率 = 融合子数/ 再生的原生质体数
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3. 原核细胞的原生质体融合
(1) 革兰氏阳性菌的原生质体融合
早期采用显微摄影术,证实拟杆菌( Bacteroids)原生质体的融合。稍后, 用同样的方法观察到普遍变形菌 ( Proteus vulga ris)、炭疽芽孢杆菌( Bacil lus anthr acis)的原生质体融合。
这个时期的研究特征是:
① 原 生质体形成就发生融合;
② 融合频率相当低, 无法估计;
③ 参与融合的亲体均为野生型, 有相同的遗传背景。
第5章现代环境生物技术原理
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真正在细菌中成功实现原生质体融合的例子是于 1976 年发表的关于枯草杆菌和巨大芽孢杆菌的融合,两者均为革兰氏阳性菌。与早期研究的不同点主要是参与融合的亲体细 胞都是带有各种遗传标记的突变型,包括营养缺陷型、对抗生素敏感型、温度敏感型、呼吸缺 陷型、带有形态及颜色标记等, 如果导致互补,则说明原生质体融合获得成功。
革兰氏阳性菌细胞融合的主要步骤为:
①培养细胞;
②收集细胞;
③细胞融合;
④重组子筛选。
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(2) 革兰氏阴性菌的原生质体融合
革兰氏阴性菌,如大肠杆菌细胞壁中的肽聚糖层远比革兰氏阳性菌薄, 但是革兰氏阴性菌的细胞壁结构复杂,有一层较厚的脂类、多糖和蛋白质组成的复杂外层,一般溶菌酶对它没有作用。因此,用溶菌酶处理制备的不称为原生质体,而称为原生质球, 因为它上面还残留部分细胞壁。
对革兰氏阴性菌而言,在加入溶菌酶数分钟后, 添加0. 1 mol/ L的 EDTA共同作用 15 ～20min,则可使 90%以上的革兰氏阴性菌转变为可供细胞融合用的球状体。细菌间细胞融合的检出率在10-5～10-2之间。
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4.真核细胞的原生质体融合
真菌主要有单细胞的酵母类和多细胞的丝状真菌类。同样,降解它们的细胞壁,制备原生质体是细胞融合的关键。
真菌细胞壁成分比较复杂,主要由几丁质及各类葡聚糖构成纤维网状结构,其中夹杂少 量的甘露糖、蛋白质和脂类, 可用消解酶(Zymolase )或蜗牛酶进行处理,也可用纤维素酶、几 丁质酶等处理,原生质体得率在90%以上。
真菌原生质体融合与前述的原核细胞融合类似, 但由于真菌一般都是单倍体, 融合后, 只有那些形成真正单倍重组体的融合子才能稳定传代, 具有杂合双倍体的异核体的融合子 遗传特性不稳定,需经多代考证才能断定是否为真正的杂合细胞。
原生质体融合重组作为基因转移的一种有效方法,需经历三个主要阶段, 即细胞融合形成异核体,不同核融合产生二倍体, 融合核交换和重组生成重组体。
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5.4.3细胞融合构建环境工程菌
1. 原生质体的制备与融合方法
(1)原生质体及其融合构建新物种
Weibull等在1953年首先提出了原生质体的概念：细胞质壁分离后去掉细胞壁所余下那部分结构称为原生质体（Protoplast）。原生质体具备原有细胞的全部内部结构与生理性能，但是它完全无细胞壁，失去了细胞的刚性而呈球形，对渗透压十分敏感。
因为去除了细胞壁，所以原生质体比较容易吸收外来的DNA、蛋白质等，同时，对外界理化因子比较敏感，在原生质体外面仅存原生质膜，在外界理化融合因子的诱导下，不同物种间的原生质体间的质膜相互融合杂交，并在适当的条件下，融合的原生质体再生出细胞壁并恢复原来完整的细胞形态与群落形态，构成具有多种遗传性状的新物种。这样就克服了传统杂交方法所面临的远缘杂交障碍。
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（2）原生质体融合方法
1）亲本的选择：选择两种适合于重组的亲本菌株，选定适宜的遗传标记，如选营养缺陷型或对抗生素具有抗性的菌株作为理想的原生质体融合的亲本菌株材料。
2）原生质体制备：选用适合的酶系，在等渗溶液中溶解细胞壁。对于酶的选择主要取决于对细胞壁成分的了解。例如，真菌的细胞壁成分主要为纤维素和几丁质，因此在制备真菌原生质体时，就应选择纤维素酶；而细菌的细胞壁成分主要为多聚糖，则常常使用溶菌酶。
在原生质体制备时，应根据所选生物材料，对原生质体产率的最佳条件进行摸索，如生物的生理状况、 pH 、酶解温度、细胞密度以及酶的浓度等。
3）原生质体的再生：酶解后得到的原生质体能够在等渗的培养基中重建细胞壁，恢复细胞完整形态，并能生长、分裂的过程称为再生。这是以融合法进行细胞遗传结构改造的前提。一般来说，原生质体比较容易在合适的培养基中再生，但其再生率差距很大，可从百分之几到百分之百。这与菌种、酶解条件以及再生条件有关。在进行原生质体融合实验前，必须作再生实验。
第5章现代环境生物技术原理
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4） 原生质体的融合与融合子的检出：目前常用的诱导原生质体融合的方法有化学促融法和电诱导法。
化学诱导法：常用于细胞融合的化学促融剂是聚乙二醇（PEG)，方法是在得到两亲本原生质体后，等量混合两亲本的原生质体，加人适量的 PEG 和钙离子溶液，保温后，洗去多余的PEG，在选择培养基上筛选出融合子。PEG的促融机理是PEG在相邻原生质体的流动镶嵌型质膜之间形成一种分子桥，沟通两亲本的质膜，改变了质膜的某些性质，并降低了原生质体的表面势能，使质膜上的蛋白质凝聚，形成了容易融合的无蛋白颗粒的磷脂双层区，导致原生质体进一步融合。
电融合法（Cell Fusion Induced by Electric Field )：即借助电场的作用，引发细胞融合。其特点是快速、简便且融合率也高，很有发展前途。其原理是：在交流电场中细胞之间相互粘连处的两极电势能高于细胞表面的其他任何一点。因此，当对电场再施加高强度的瞬时电脉冲时，电势能最高的两细胞接触处的细胞膜首先破裂，脉冲消失后，不同细胞的破裂细胞膜又相互粘连，形成了两细胞的融合子。图5-53是电诱导细胞融合原理示意图。
第5章现代环境生物技术原理
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第5章现代环境生物技术原理
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2.原生质体融合构建环境工程菌
原生质体融合技术在环境科学及废水处理研究中的应用始于20世纪80年代。在生物降解反应中，微生物细胞间的互生现象普遍存在，究其机理，可能是由于微生物间相互提供了彼此生长或发生降解反应所需的某种生长因子，或是由于互补作用形成一个所需降解酶活性很高的反应体系。对于有互生作用的细胞，通过原生质体融合技术，可将多个细胞的优势集中到一个细胞内。
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1)原生质体融合构建苯环化合物降解菌
Pseudomonas alcaligenes CO 可降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯，但不能利用甲苯，Pseudomonas putida R5-3 可以降解苯甲酸酯和甲苯，但不能利用3-氯苯甲酸酯，两菌株均不能利用1, 4-二氯苯甲酸酯，融合后得到可以同时降解上述4种化学污染物的融合子CB1- 9。说明通过原生质体融合可以集中双亲的优良性状，并可产生新的性能，这一现象有着极为重要的应用价值。用来自乙二醇降解菌Pseudomonas mendciina 3RE-15和甲醇降解菌 Bacillu lentus 3RM-2- 的DNA，转化至降解苯甲酸和苯的 Acinetobacter calcoaceticus T3 的原生质体中，获得的融合菌株TEM-1可同时降解苯甲酸、苯、甲醇和乙二醇，降解率分别为100％、100％、84.2％、63. 5 %，此菌株用于化纤污水处理，对COD去除率可达 67.36 %，高于三株菌混合培养时的降解能力。
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2)原生质体融合构建纤维素降解菌
两株脱氢双香草醛（DDV）降解菌 Fusobacterium varium 和 Enteroccus foecium ( DDV 是与纤维素相关的有机化合物）在分别作用时，8d降解3％-10％的脱氢双香草醛；混合培养时降解率可达到30%，说明有明显的互生作用存在。将两株菌进行原生质体融合，融合率为0.9×10-5-1.3×10-5，从中获得5株融合子，其降解活力上升2-4倍，其中FE7菌株降解率高达80%，利用Southem DNA 印迹杂交技术进行检测后证实，融合子中确实带有双亲的DNA序列。从这一研究可以看出，原生质体融合得到的重组子细胞降解力，不仅高于两个亲株作用，甚至还远远高于两个亲株混合培养的降解力。
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将重组子FE7和革兰氏阳性具有纤维素分解能力的白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）进行融合，将纤维素降解基因引人到FE7中，结果融合率为3. 3 ×10-7- 3.0×10-6时，获得一株革兰氏阳性重组子，它具有Ruminococcus albus亲株45％-47％的β-葡萄糖苷酶和纤维二糖酶活性，同时还具有8 % FE7降解脱氢双香草醛酶活性。利用基因探针技术证实它是一个完全重组子。为了获得能分解利用纤维素水解物，并高效产生乙醇的菌株，将一株利用纤维二糖能力强的Ca ndida abtusa和产乙醇率高的发酵接合糖酵母（Zygosaccharomyces fermentati）进行原生质体融合，融合率达到2×10-7，筛选出的融合子不但能以纤维二糖为唯一碳源生长，而且产乙醇能力高于双亲。融合了两株有协同作用的绿胞链霉菌（Streptomyces viridosporus ) TTA 和西康氏链霉菌（S.setonii ) 75viz, 19株融合子中4株降解玉米秆木质纤维素能力比亲株高出 155％-264％。
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