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5.5发酵工程
5.5.1发酵工程概述
发酵（Fermentation）是微生物分解有机物，产生乳酸或乙醇和二氧化碳的作用过程。也泛指一般利用微生物制造原料或产品的过程，可在无氧或有氧条件下进行。发酵依靠微生物体内或体外的酶，将基质包括有机污染物在内的大分子分解成微生物细胞能吸收的小分子化合物，并参与细胞的合成代谢。发酵提供细胞生命活动所需的能量和各种细胞结构物质，建造新的细胞。
发酵工程（Fermentation engineering），是指将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机结合起来，采用现代工程技术手段，利用微生物的生长和代谢活动为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。
因此，利用发酵工程的原理与技术，净化处理环境污染物，同时产生有用的产品，可以达到减轻环境污染目的，同时实现废物资源化，提高整体工艺的效益，降低运行成本。生物发酵技术已应用在环境污染处理的多方面，如有机废物的堆肥过程中的发酵、废纤维素的糖化、蛋白化和乙醇化等。
第5章现代环境生物技术原理
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5.5.2发酵工程的内容
发酵工程的主体为利用微生物, 特别是经 DNA 重组技术改造的微生物来生产有用物质。发酵工程的内容随着科学技术的进步而不断扩展和充实。现代发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产,还包括微生物机能的利用(图5-54)。
第5章现代环境生物技术原理
发酵工业的内容包括生产菌种的选育,发酵条件的优化与控制, 反应器的设计及产物的 分离、提取与精制等
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1.发酵类型
（1）微生物菌体发酵
这是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。传统的菌体发酵工业包括用于制作面包的酵母发酵及用于人或动物食品的微生物菌体蛋白(单细胞蛋白) 的生产。新的菌体发酵 可用来生产一些药用真菌,如香菇类、冬虫夏草菌、灵芝等。有的微生物菌体还可以用作生物防治剂,如苏云金杆菌、蜡样芽孢杆菌和侧芽孢杆菌，其细胞中的伴孢晶体可毒杀鳞翅目、双翅目的害虫。丝状真菌的白僵菌、绿僵菌可防治松毛虫等。所以某些微生物的剂型产品，可以制成新型的微生物杀虫剂，用于农业生产中。
（2）微生物酶发酵
微生物具有种类多、产酶的品种多、生产容易和成本低等特点, 因而目前工业应用的酶 大多来自微生物发酵。
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（3）微生物代谢产物发酵
微生物代谢产物的种类很多,已知的有37大类,其中16类属于药物。
根据菌体生长与产物形成时期之间的关系,可以将发酵产物分为两类。
1）初级代谢产物
在微生物对数生长期所产生的产物,如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等, 是菌体生长繁殖所必需的。这些产物叫初级代谢产物(Primary metabolite)。许多初级代谢产物在经济上具有相当的重要性,因而形成了不同的发酵工业, 如微生物酶、有机酸、维生素、多糖、氨基酸和核酸类等物质的发酵。 由于初级代谢产物是供菌体生长繁殖使用的, 所以野生菌株合成产物的产量在满足自身的需要之后,就受到许多调节机制的控制而停止合成, 为了提高发酵产物的产量, 就要了解菌株在合成产物中受哪些调节机制的控制,通过研究,修饰菌体的遗传基因和改良培养条件,以解除其控制,才能获得高产量。
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2）次级代谢产物
在菌体生长静止期,某些菌体能合成在生长期中不能合成的、具有一些特定功能的产物,如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系, 称为次级代谢产物（Secondary metabolite）。次级代谢产物多为低分子量化合物，但其化学结构类型多种多样，它们具有较大的经济价值。形成次级代谢产物的菌体生长时期称为生产期。在菌体低生长速率的连续培养中也会出现次级代谢, 因而可认为次级代谢产物的形成是菌体缓慢生长或停止生长的情况下的一种特征,次级代谢与初级代谢并非独立的代谢途径,两者有密切的关系,初级代谢的中间体或产物往往是次级代谢的前体物或起始物.
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（4）微生物转化发酵
微生物转化（Microbial transformation）就是利用微生物细胞的一种或多种酶, 把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。生长细胞、静止细胞、孢子或干细胞均可进行转化反应。可进行的转化 反应包括脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、脱羟反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等。
生物转化最明显的特征是特异性强, 包括反应特异性( 反应的类型 )、结构位置特异性 (分子结构中的位置) 和立体特异性(特殊的对映体) 。生物转化与其化学反应相比具有许多 优点,如反应条件温和, 对环境污染小等。
（5）生物工程细胞的发酵
这是指利用生物工程技术所获得的生物细胞,如 DNA重组的“工程菌(Engineering bacteria)”、细胞融合所得 到的“杂合细胞”以及动植物细胞、固定化细胞等, 进行培养的新型发酵。其发酵产物多种多 样,所用的发酵设备是各种类型的新型生物反应器。发酵工艺也与传统工艺有所不同。
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2. 发酵方法
(1)表面发酵
将菌种接种到灭过菌的液体(或固体) 培养基上,在一定温度下进行培养。一般地,好氧微生物菌体在液体表面上形成一层微生物膜,固体培养基上也能形成这种膜,经过一定时间 培养后,菌体产生的代谢产物,或扩散到培养基中,或留在微生物细胞内,或两者都有,这要据菌体和产物的特性而定,产物产量达到高峰后,进行提取。该法劳动强度大,占地面积大,产量低,易污染,已被深层培养法所取代。但该法仍具有简单易行,投资少,适用于小型生产等特点,且对原料要求粗放。在某些产品的发酵生产中, 仍采用此法,如农用抗生素赤霉素的生产,以麦麸为培养基进行固体发酵, 基结果优于深层培养所得的结果,糖的转化率和产物产量都较高。
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(2)深层发酵
深层发酵(Submerged fermentation)是微生物细胞在液体深层中进行培养的方法。随供气方式的不同,好氧深层发酵可分为振荡培养和深层通气( 搅拌)培养。振荡培养,即所谓的摇瓶振荡培养,培养微生物所需的氧气是在外界空气与培养液在振荡时进行自然交换提供的。深层(搅拌)通气培养是强制通入无菌空气到密闭发酵罐中进行(搅拌)培养的方式,微生物所需的氧是外界通入空气中的氧经过溶解后提供的。深层发酵法具有生产效率高,占地小, 可人为控制等优点,广泛应用于抗生素、维生素、有机酸、酶制剂等生产中。
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3.发酵过程
微生物发酵过程即微生物反应过程，是指微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应过程。根据微生物的种类不同，可以分为好氧性发酵（在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气）和厌氧性发酵（在发酵过程中不需要通入空气）两大类。酵母菌是兼性厌氧微生物，它在缺氧条件下进行厌氧性发酵积累酒精，而在有氧即通气条件下则进行好氧性发酵。大量繁殖细胞。
发酵过程包括菌种制备、种子培养、发酵、产物提取精制等(图5-55 )。
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(1)菌种
在进行发酵生产之前,必须从自然界分离得到能生产所需产物的菌种,并经分离、纯化 及选育后,或是经基因工程改造后的“工程菌”, 才能供发酵使用。为了能保持和获得稳定的高产株,还需要定期进行菌种纯化和育种,筛选出高产量和高质量的优良菌株。
(2)种子扩大培养
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管或冰箱中处于休眠状态的生产菌种，接入试管斜面活化后，在经过茄子瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程（图5-56）。种子制备有不同的方式。发酵产物的产量与成品的质量、菌种性能和种子制备情况密切相关。种子制备的培养方式和培养级数, 取决于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。
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(3)发酵
发酵是微生物合成大量产物的过程,是整个发酵工程的中心环节。发酵是在无菌状态下进行纯种培养的过程,因此, 所用培养基和培养设备都必须经过灭菌,通入的空气或中途的补料都是无菌的。转移种子也要采用无菌接种技术。 发酵罐内部的代谢变化(包括菌体形态、菌体浓度、底物浓度、氮含量、pH值、溶解氧浓度、产物浓度等) 是比较复杂的,特别是次级代谢产物( 如抗生素)发酵就更为复杂, 它受很多因素的控制。现在发展起来的生化工程这门学科专门研究的就是发酵罐内菌体代谢变化规律和控制方法,同时,也开发新型生物反应器,来满足发酵工程新的要求。影响发酵的因素错综复杂,又相互影响,相互制约,所以,要使发酵达到预期的结果,需要各方面密切配合和严格操作,精心管理。
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(4)下游处理
发酵结束后,发酵液或生物细胞要进行分离和提取精制,以将发酵产物制成合乎要求的 成品。 发酵工程,除上述几个基本过程外, 对发酵产品来说,还有按产品的标准进行成品检测 和按商业要求进行成品包装等工序。对发酵工业来说,还有发酵工业经济学和发酵后的废液处理等问题。
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5.5.3发酵过程及其控制
1.发酵的操作方式
微生物的发酵根据操作方式可分为分批发酵(Batch )、补料分批发酵 (Fed-batch)和连续发酵 (Continuous fermentation )三种类型。
(1)分批发酵
分批发酵时是指营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。其特征为微生物的生长、各种营养物质的消耗和代谢产物的合成都时刻处于变化之中,整个发酵过程处于不稳定状态。分批发酵是传统的发酵培养方式,其生产是间断进行的。每进行一次培养就要经过灭菌、装料、接种、发酵、放料等一系列过程。分批发酵的工艺如图5-57所示。
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(2)连续发酵
连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基, 同时以相同的速度流出培养 液,从而使发酵罐内的液量维持恒定, 微生物在稳定状态下生长。连续发酵的工艺如图5-58所示
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连续发酵的控制方式有两种:
恒浊法(Turbidostat)
利用浊度来检测细胞的浓度,由控制生长限制基质的流量来维持恒定的菌体浓度。
为恒化法(Chemostat)
以某种必需营养作为生长限制基质,通过控制其流加速率造成适应于这种流加条件的生长密度和生长速率,它与恒浊法的相同之处是维持一定的体积,不同之处是菌体浓度不是直接控制的,而是通过恒定输入的养料中的某一种生长限制基质的浓度来控制。
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与分批发酵相比,连续发酵优点:
1)可以维持稳定的操作条件,有利于微生物的生长代谢,从而使产率和产品质量也相应保持稳定;
2)能更有效地实现机械化和自动化,降低劳动强度,减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会;
3)减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间,提高了设备利用率;
4)连续发酵时细胞的生长状态更一致,产物生产的持续性更好;
5)生产同样量的产物,连续发酵所用的生物反应器比分批发酵的要小;
6)由于灭菌次数减少,使测量仪器的探头寿命延长; g)容易对过程进行优化, 有效地提高发酵产率。
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连续发酵的缺点:
1)对设备、仪器及控制元器件的要求较高,从而增加投资成本;
2)由于是开放系统, 加上发酵周期长,容易造成杂菌污染;c)在长期连续发酵中,微生物易发生变异;
3) 粘性丝状菌菌体容易附在器壁上生长及在发酵液内结团,给连续发酵操作带来困难;
4)长时间维持工业规模生产的无菌状态是很困难的。 由于上述原因,连续发酵目前主要用于理论研究中, 如发酵动力学参数的测定,过程条件的优化等,已经应用于工业生产的有单细胞蛋白生产、废水生物处理等。
将固定化细胞技术与连续培养方法相结合,是一种应用前景看好的方法,已用于生产丙酮、丁酸、异丙醇等重要工业溶剂。
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(3)补料分批发酵
补料分批发酵又称半连续发酵,是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术,是指 在微生物分批发酵中,以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。在发酵的不同时间不断补加一定的养料,可以延长微生物对数期与静止期的持续时间,增加生物量的积累和静止期细胞代谢产物的积累。
补料在发酵过程中的应用,是发酵技术上的一个划时代的进步。补料技术本身由少次多量、少量多次,逐步改为流加,近年又实现了流加补料的微机控制。
补料分批发酵可以分为两种类型:
1)单一补料分批发酵;
2)重复补料分批发酵。
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补料分批发酵作为分批发酵向连续发酵的过渡,兼有两者的优点, 而且克服了两者的缺点。同传统的分批发酵相比,其优越性是明显的。
首先,它可以解除营养基质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。对于好氧发酵,它可以避免在分批发酵中因一次性投入基质过多而造成细胞大量生长,耗氧过多,以至通风搅拌设备不匹配的状况。
在某些情况下还可以减少菌体生成量,提高产物的转化率。与连续发酵相比,它不会产生菌种老化和变异问题,其适用范围也比连续发酵广。
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2. 发酵过程控制
发酵过程控制是根据对过程变量的有效测量及对过程变化规律的认识,借助于由自动 化仪表和计算机组成的控制器,操纵其中的一些关键变量,使过程向着预定的目标发展。
发酵过程控制包括三方面的内容:
1)和过程未来状态相联系的控制目的或目标,如要求控制的温度、pH、生物量浓度等;
2)一组可供选择的控制动作, 如阀门的开、关, 泵的开、停等;
3)一种能够预测控制动作对过程状态影响的模型, 如用加入基质的浓度和速率控制 细胞生长率时需要能表达它们之间相关关系的数学式。目前常用的控制系统如图 5-59所示。
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可对多个发酵罐同时进行控制
通过计算机控制取样装置,分别对多个发酵罐的液体和排出气体的组成进行自动分析,分析结果由分析仪器计算机直接送到发酵过程控制的监 控计算机,对发酵过程实施优化控制。 随着计算机技术和控制理论的发展,计算机控制系统在发酵工业中的应用不断发展, 实现了发酵过程参数的在线实时检测、记录、图形显示、数据自动存储、报表打印和环境参数的自动控制。也可依据控制程序或适当的模型或专家系统对发酵过程进行控制。这些为发酵 过程的优化控制奠定了良好的基础。
过程监控计算机的作用有: a)在发酵过程中采集和存储数据; b)用图形或列表方式显示存储的数据;c)对存储的数据进行各种处理和分析;d)与检测仪表和其他计算机系统进行通讯; e) 对模型及其参数进行辨识;f)实施复杂的控制算法。
监控计算机应具有尽可能完善的功能和较高的可靠性、一定的升级能力、简单的运算要 求、与其他系统的通讯能力等。
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3.发酵动力学
发酵动力学(Fermentation kinetics)是发酵工程的一个重要组成部分, 它研究各种发酵过程中变量在活细胞的作用下变化的规律,以及各种发酵条件对这些变量变化速度的影响。发酵过程动力学研究有助于更加深入地认识和掌握发酵过程,为工业发酵的模拟、优化和控制打下理论基础。
(1)微生物生长动力学
1)Monod 方程
微生物接种到灭菌的培养基之后,细胞数目并不立即增长,这一时期称为延迟期。这是 因为细胞为适应新的环境,需要重新启动它们的代谢系统。在延迟期之后,对数期之前,细 胞生长速度逐渐加快的时期称为加速期。微生物生长的6个典型时期为: 延迟期、加速期、对数期、减速期、停滞期和死亡期 (图5-60 )。
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2)其他生长动力学方程
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(2)产物形成动力学
微生物代谢产物,尤其是次级代谢产物的生物合成,是一个十分复杂的生化过程,它涉及到所用菌株的基因型和表型、菌体的生长速率、形态和生理状态,并取决于各种营养基质、 前体物和氧的供给及其他外部环境条件,而一些外部环境条件对菌株生长和生产能力的影 响尚不十分清楚,因此,大多数研究只限于对宏观过程变量描述的非结构模型,下面简单介绍一些常见的产物合成动力学模型。
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5.5.4发酵生物反应器
生物反应器(Bioreactor)是利用生物催化剂进行反应的设备。按照所使用的生物催化剂, 生物反应器可分为酶反应器和细胞反应器两类。发酵罐是微生物细胞反应器,是最重要的一种生物反应器。
以发酵罐为主体,半个多世纪以来,已形成一整套生化工程设备,其进步表现在以下几个方面:
1)染菌率极低。现代发酵多为纯种培养, 因为杂菌入侵将干扰正常生产。培养基的彻底灭菌、空气的灭菌、设备的严密度和科学管理形成了防止杂菌污染的基础。
2)发酵设备大型化。发酵罐的体积从几十立方米增加到几百至几千立方米, 设备大型化有利于提高经济效益。
3)利用生物技术优化发酵过程, 大幅度提高产量和降低成本。
4)改进后处理工艺和设备, 采用先进设备提高产品的回收率和质量。
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生物反应器一般都要求杜绝杂菌和噬菌体污染。为了便于清洗,消除灭菌死角,生物反应器的内壁及管道焊接部位都要求平整光滑,无裂缝、无塌陷。在工业生产中使用的生物反应器还要便于对反应器内的温度、pH值、氧气含量等进行监测和控制。
目前,生物反应器主要包括以下几种基本类型:
1) 搅拌式生物反应器( Stirred tank reactor, STR) 内设搅拌装置[图5-71 (a)]；
2)鼓泡式反应器( Bubble column ) 搅拌主要依赖于引入的空气或其他气体 [图5-71 (b)]；
3)气升式反应器 ( Airlift reactor) 内设内置或外置的循环管道,由于引入气体的运动,导致反应器内培养液进行混合,并保持循环流动[图 5-63(c)、( d)] 。
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最传统、至今使用最广泛的生物反应器是搅拌式反应器。工业上常用的发酵罐的结构如图5-64所示。
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5.5.5发酵工程在环境污染治理中的应用
1.亚硫酸盐纸浆废液乙醇发酵
亚硫酸盐纸浆废液中含有较多的木质素盐和相当数量的糖类，总固形物约9％-17%，其中有机物占总固形物的85％-90％。亚硫酸盐纸浆废液中可发酵性糖的来源主要是半纤维素。为了使亚硫酸盐纸浆废液能用于乙醇发酵，必须经过预处理，即通人空气，使有害物质SO2得以挥发，用石灰水等碱性溶液中和废液的酸，pH调为5.4-5.5，将中和过程中产生的硫酸钙和亚硫酸钙采用沉降法将其除去。在澄清液中添加氮和磷，然后在发酵罐中加人絮状酵母，并通人空气搅拌，进行乙醇发酵。发酵液流人澄清罐，将沉淀的酵母留在澄清器底部中心，并再回流到发酵罐中，而澄清液送去蒸馏，生产乙醇。
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2.酵母循环系统
酵母循环系统是指利用酵母菌-活性污泥二段式好氧处理废水的系统。日本西原环境研究所用生产面包的废水进行微生物混合培养，结果分离出了酵母和其它两种微生物。研究人员认为，既然酵母也能有效地处理废水，那么处理后的剩余污泥是酵母的集合体，其中含有大量的蛋白质、维生素和脂肪等多种物质，完全可以用来制作饲料或肥料，从而一举解决了活性污泥法剩余的污泥问题。这样就产生了一种利用酵母的新式食品废水处理系统-酵母循环系统。
与细菌活性污泥系统相比较，酵母废水处理系统的性能大大提高。酵母废水处理系统的日处理能力达10-15 BODkg/m3，是细菌法的5-7倍。酵母槽中的酵母浓度高达10-15g /L，酵母絮体结构呈海绵状，空径大，非常易于氧气的扩散，因而混合液的溶解氧水平可以降低到0.3-0.8g/L ，相应的送风量只需活性污泥法的60%，而海绵状的酵母污泥可在常压下脱水，无需添加药剂。
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3.废纤维素的资源化
1)纤维素——制糖工艺
工艺由制酶、原料预处理、水解与糖浆回收三阶段组成 ，纤维素酶来自绿色木霉。
2)纤维素肥料 ——单细胞蛋白技术
一些放线菌菌株能广泛分解纤维素、半纤维素、木质素和淀粉等有机物产生单细胞蛋白，对纤维素的得率为45％左右 。
3)纤维素——生产乙醇工艺
用混合培育方法可直接将纤维素转化为乙醇，即用热纤梭菌来水解纤维素，同时运用热解糖梭菌把前者不能代谢的戊糖转化为乙醇，从而可以同时将戊糖和己糖转化为乙醇，并使纤维素水解和乙醇发酵结合进行，理论最高产量85％
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4.有机固体废物的快速堆肥
堆肥从传统的露天静态堆肥法向快速堆肥法发展。
代表工艺：达诺式（DANO）回转圆筒型发酵仓工艺
在有机物含量大于 40％时，主发酵期为3—4d ，实现无害化处理。
进入后发酵期，用10—11d 达到完全稳定化。
主发酵期
后发酵期
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从自然界中筛选旺盛增殖的嗜粪微生物，用它们接种后，可明显加快发酵进程。
向有机肥料中接种白色腐朽菌，有利于难降解的木质素加快分解 。
对植物性废弃物和城市污泥进行加酶处理，在沼气发酵时的甲烷产量可有大幅度提高。
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复习题
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第5章现代环境生物技术原理

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