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7.有害有机物微生物降解中的生物化学
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7.2.1卤代烃类微生物降解的生物化学
卤代有机化合物是一类非常重要的化合物，被广泛地应用于工业、农业、农药、有机合成。由于应用广泛，因此，卤代有机化合物进入环境的机会也就很大，途径也很多。概括起来，环境中的卤代有机物主要来自人工应用、自然生成和人工条件下的有机物卤化。
卤代有机化合物中卤代脂肪烃和卤代芳香族化合物是最重要的两类。而卤元素中最重要的是氯，其次是溴和氟。环境最重要的卤代有机化合物是氯化脂肪烃和氯化芳香烃，如三氯甲烷、多氯联苯等。
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7.2典型有害有机污染物微生物降解的生物化学
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1.卤代脂肪烃的降解
卤代脂肪烃广泛用于工业溶剂、清洗剂、气雾推进剂和化工合成的中间体。主要是C1和C2脂肪烃，其上氢原子被一个或多个卤原子取代。
卤代脂肪烃在环境中可以进行非生物转化，例如在水中的取代反应、脱氢脱卤反应和还原反应。过渡金属如Ni、Fe、Cr和Co可以还原卤代脂肪烃，产物为氧化态金属和脱卤的烷烃。好氧和厌氧微生物都已经用于卤代脂肪烃的降解和环境修复。
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（1）好氧降解
好氧降解研究最多的是TCE。甲基营养菌在有甲烷和天然气存在的情况下可以降解TCE。
对卤代脂肪烃好氧降解的了解还不完全，最初的氧化作用由单加氧酶或双加氧酶催化。由于单加氧酶和双加氧酶的特异性较低，所以它们的降解可以与脂肪烷烃和芳烃降解使用相同的加氧酶系。降解需要有代谢基质(甲烷、甲苯／酚或氨)存在，是一种共代谢作用。
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（2）厌氧降解-还原性脱卤
厌氧条件下的降解过程称为还原性脱卤作用，卤原子从分子中逐个脱去并被氢原子取代。在厌氧条件下有机化合物脱卤在热力学上是有利的。
脱卤作用取决于分子的氧化还原电位，而这又是由卤-碳键强度决定的。键强度越高，卤原子越难脱去。键强度与卤原子的类型和数目有关，也与卤代分子的饱和程度有关。
饱和化合物(烷烃类)比不饱和化合物(烯、炔烃类)的还原性脱卤敏感。在卤代烯烃厌氧代谢中，其脱卤速率由快到慢依次是：四氯乙烯、三氯乙烯、1，2-二氯乙烯和氯乙烯。前面的氧化状态高于后者。
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一些卤代脂肪烃的厌氧生物降解见表7-3。
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2.脱卤反应机制
氯代脂肪烃化合物的微生物代谢关键步骤是脱卤反应。催化这一反应的酶可以直接作用于C-Cl键，或不直接作用于C-Cl键，而和氧结合形成不稳定的中间物。
目前在好氧细菌中发现5种脱卤机制(图7—5)。
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（1）亲核置换
有谷胱甘肽转移酶(GST)参与，形成谷胱甘肽和卤代脂肪烃共价结合的中间物，最后脱卤。例如生丝微菌在二氯甲烷基质中脱氯就是这种方式，脱氯的产物是甲醛。
（2）水解
水解脱卤酶参与氯代脂肪烷烃的脱卤反应，其反应产物是对应的醇。这类氯代脂肪烷烃有2-氯代羧酸、1-氯代正烷烃、α，ω-二氯正烷烃、α，ω-氯代醇以及其他相关化合物。例如，自养黄色杆菌GJ10以1，2-二氯乙烷为惟一碳源，在两种不同的水解脱卤酶作用下经过两次水解脱氯作用，生成产物乙醇酸，然后进人中央代谢途径，见图7-6。
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（3）氧化
由单加氧酶催化，需要还原性辅助因子或细胞色素，分子氧中的一个氧原子与基质结合，另一个氧原子形成水。单加氧酶反应在性质上是亲电反应而不是亲核反应，因此这种氧化反应为结构上对亲核取代反应不敏感的化合物的降解提供了另一种途径。氯仿在这种方式下氧化产生不稳定的中间物。
（4）分子内部亲核取代
由单加氧酶或双加氧酶催化，形成环氧化物，然后再脱去氯。如反-1，2-二氯乙烯在甲基营养细菌作用下的降解(图7—7)。
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（5）水合
具有不饱和键的卤代烃水合后脱卤。 例如3-氯代丙烯酸水合脱氯形成丙醛酸。
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3.典型卤代脂肪烃的降解
（1）氯代烷烃的降解
二氯甲烷在好氧条件下可以作为生长基质被利用。二氯甲烷的脱氯可以由依靠谷胱甘肽的脱氢酶催化，该酶的DNA已被克隆并进行了序列分析。
三氯甲烷或四氯甲烷是由严格厌氧菌降解，有两种方式：一种是取代脱卤，转化为CO2，是一种由金属卟啉催化的非酶过程；一种是还原性脱卤，三氯甲烷依次转化为二氯甲烷、氯甲烷，最后是甲烷。同一种菌可以有两种代谢方式。
许多假单胞菌和Hyphomicrobium能将氯代烷烃作为初始底物代谢。研究表明，氯代烷烃的完全代谢有3种不同途径，见图7—8。
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（2）氯代烯烃的降解
甲烷营养菌可以氧化三氯乙烯 (TCE)，因为甲烷单加氧酶是一个特异性很低的氧化酶，可以催化多种有机物的氧化。用甲烷营养菌降解TCE的研究试验，遇到以下问题：
1）甲烷单加氧酶对甲烷有比对TCE较高的亲和性，甲烷是TCE代谢的竞争性抑制剂。
2）在TCE氧化过程中，该酶活性有不可逆的损失。
3）TCE氧化时需要外部补充能量。
除甲烷单加氧酶可以氧化TCE以外，还有氨单加氧酶、异戊二烯氧化酶、丙烷单加氧酶、甲苯-邻-单加氧酶和甲苯双加氧酶等。上述酶系都需要有适当的诱导物存在时才合成，但它们可能是有毒有机物。
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TCE的氧化作用产物取决于最初氧化作用的机制。单加氧酶作用产生TCE环氧化物，然后自发地水解为二氯乙酸、乙醛酸、甲酸和CO (图7-9) ；而双加氧酶作用最初产TCE-二氧杂环化物和1，2-二羟基-TCE，然后重排形成甲酸和乙醛酸。前者由甲烷营养菌氧化，最后产物为其他菌所利用。在这个过程中，有少量副产物三氯乙醛，后者是由假单胞菌作用，两者均不能使四氯乙烯共代谢。
四氯乙烯在产甲烷条件下还原性脱卤，经过四个步骤产生乙烯，降解的中间物为三氯乙烯、顺/反-二氯乙烯和氯乙烯(图7-10) 。
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研究证明，不在产甲烷的条件下，只要有足够的甲醇存在该过程就可以进行。研究还表明从四氯乙烯到氯乙烯，这类溶剂具有生物修复上的潜力，但在现场这个过程很少能完成，会有一些中间物(如氯乙烯)的积累。氯乙烯在好氧条件下可以作为生长基质供微生物利用，但容易挥发，在生物反应器中处理较困难。
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4.卤代芳烃的降解
卤代芳烃的降解性取决于卤原子的性质、数目和位置。卤代物为溴和碘时比氯容易降解，为氟时比氯难降解。好氧降解性随卤原子的数目增加而下降，但厌氧脱卤则相反。
（1）卤代苯的细菌氧化
卤代苯对细菌的氧化作用不足很敏感的。然而某些卤代苯可以被细菌气化，可用图7-11说明。
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（2）氯代苯甲酸的降解
虽然氯化苯甲酸不会引起环境问题，但是它们常常被作为研究对象。这是由于它们溶于水、没有毒性，而且是研究卤代芳香族化合物脱卤机制的理想模型。
1）2-氯苯甲酸的降解
在双加氧酶催化下，2-氯苯甲酸降解的第一步反应是去除氯生成儿茶酚，如图7-12 。
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2）3-氯苯甲酸的降解
与2-氯苯甲酸的降解完全不同，在双加氧酶的作用下第一步不是脱氯而是形成3-氯代儿茶酚或4-氯代儿茶酚。氯代儿茶酚正位裂解，而后环化形成内酯脱氯(图7-13) 。
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3） 4-氯苯甲酸的降解
在降解反应的第一步就脱去氯，被水中的羟基取代。该脱卤反应是经水解反应除去苯环中的氯的仅有的例子。酶是双成分酶系统，反应在ATP的作用下形成4-氮苯甲酰CoA酯作为中间物 (如图7-14) 。
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（3）多氯联苯的微生物降解
多氯联苯(PCBs)是联苯氯化的产物，商品多为不同氯取代的混合物。多氯联苯的微生物降解首先是从联苯的芳环上开始的， 多氯联苯微生物降解的程度与其结构和微生物有关，多氯联苯的微生物降解途径可用图7-15表示。
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7.2.2农药微生物降解的生物化学
农药(Pesticide)的微生物降解，就是通过各种微生物的作用将大分子有机物分解成小分子化合物的过程。
化学合成的农药一般都比较稳定，能在土壤中停留较长时间，甚至高达十年以上，在环境中的大量积累，造成了严重的环境污染。
1.苯氧乙酸的微生物降解
苯氧乙酸是一大类除草剂，2、4-D是其中常用的一种。经研究，降解苯氧乙酸的细菌有假单胞菌属(Pseudomonus)、棒状杆菌属（Corynebacterium)、诺卡氏菌属( Nocardia)、枝动菌属(Mycoplana)、真菌类有黑曲霉(A.niger)。 其降解途径如图7-16。
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2.DDT的生物降解
DDT又叫滴滴涕，化学名为双对氯苯基三氯乙烷（Dichlorodiphenyltrichloroethane）在土壤中的平均半排出期为三年，其中5%-10％在使用后十年仍留在土壤内，近年的研究取得了一些新进展。
A．W．A.Brown把DDT在土壤中和微生物培养物中的降解途径作了以下归纳(图7-17）。
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参与降解的细菌类有10属，23种，如假单胞菌属(Pseudomonas)6个种、黄单胞菌属(Xanthomonas)4个种，欧文氏菌属(Erwinia)4个种、芽胞杆菌(Bacillus)3个种等。
真菌类有：啤酒酵母(Sa.cerevisiae)能在50小时内使DDT脱氯超过一半；绿色木霉(Tri.viride)18个菌株能对DDT有不同的降解作用。
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7.2.3洗剂剂微生物降解的生物化学
洗涤剂(Dtergent)是人工合成的高分子聚合物，由于难于被微生物降解，导致洗涤剂在自然界中蓄积数量急剧上升，不仅污染了环境，而且也能破坏自然界的生态平衡。因此，洗涤剂是目前最引人注目的环境污染的公害之一。
合成洗涤剂的主要成分是表面活性剂。
根据表面活性剂在水中的电离性状分为：阴离子型、阳离子型、非离子型和两性电解质型四大类。其中以阴离子型合成洗涤剂应用得最为普遍。
阴离子型的表面活性剂包括有合成脂肪酸衍生物、烷基磺酸盐、烷基硫酸酯、烷基苯磺酸盐、烷基磷酸酯、烷基苯磷酸盐等；
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阳离子型主要是带有氨基或季铵盐的脂肪链缩合物，也有烷基苯与碱性氯原子的结合物；
非离子型是一类多羟化合物与烃链的结合产物，或是脂肪烃和聚氧乙烯酚的缩合物；
两性电解质型则为带氮原子的脂肪链与羟酰、硫或磺酸的缩合物。
合成洗涤剂基本成分除了表面活性剂外还含多种辅助剂，一般为三聚磷酸盐、硫酸钠、碳酸钠、羟基甲基纤维素钠、荧光增白剂、香料等，有时还有蛋白质分解酶。
家庭用的洗涤剂通称洗衣粉，有粉剂、液剂、膏剂等形式。我国现在主要产品属阴离子型烷基苯磺酸钠型洗涤剂，一般称中性洗涤剂，对环境的污染最为严重。
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洗涤剂的种类很多，一般都很难被微生物降解，最难被微生物降解的是带有碳氢侧链的分子结构-ABS型，这种洗涤剂不能被微生物降解的原因是碳氢侧链中有一个4级碳原子（即直接和4个碳原子相连的碳原子），结构如下：
4级碳原子的链十分稳定，对化学反应和生物反应都有很强的抵抗性，因此ABS很难被生物降解。
为使合成洗涤剂易为生物所降解，人们改变了合成洗涤剂的结构，制成易被微生物分解的(软型)洗涤剂，其代表为直链烷基苯磺酸盐(LAS)。
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由于去掉了4级碳原子，并利用了侧链的碳氢化合物，其直链部分易于分解的特点，使LAS较易为生物降解，而且在一定的范围内，碳原子数愈多，其分解速度也愈快。
LAS的降解过程中，首先烷基末端的甲基被氧化成羧酸，再经β-氧化，每次减少两个碳，最终生成苯丙酸，苯乙酸或安息香酸的磺酸盐，然后进行脱磺化作用。途径如下，苯环经过一羟基或二羟基化后开裂而被降解。
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7.2.4石油污染物微生物降解的生物化学
1.石油污染物概述
石油是重要的能源物质，在石油开采、运输、加工、使用等过程中均可能产生对环境的污染。据统计，由于战争、海难及其他事故，每年都有数干甚至上万吨石油泄漏到海中。此外，也不乏石油泄漏问题引起水体、土壤等污染的例子。这类问题在世界范围引起了科学界广泛关注。
石油是一类物质的总称，主要是碳链长度不等的烃类物质，最少时仅含一个碳原子。例如石油天然气中的甲烷，最多时，碳链长度可超过24个碳原子，这类物质常常是固态的，例如沥青。从气体、液体到固体，各种物质组分的物理化学性质相差很远。同时，不同物质的生物可降解性也相差很大，有的物质具有很好的可生物降解性，但有的则很难降解，进人环境中可残留很长时间，造成一种长期的污染。
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石油中的主要成分是烷烃类物质，但石油污染物则十分复杂。石油的主要成分并不是石油污染的主要物质，当然，溢油污染时主要是以烷烃类为主要成分，但是造成长期污染的是那些成分复杂的物质。许多因石油污染而检测出的环境污染物质大多是经过环境的转化后的产物。例如卤化产物，卤化过程使得污染物的稳定性、生物毒性等都发生变化。
石油中的元素以碳和氢为主，其中碳占83％-87％，氢占11％-14％，含有少量硫(0.06％-8.0％)、氮(0.02％-1.70％)和磷(0.08％-1.82％)。石油中还含有极少量的金属元素，如钒、铁、铜等。石油组分中，不同组分的分子量相差很大，从几十到几千。总的来说石油是不溶于水的，但能与水形成稳定的乳状液，特别是在低浓度范围，许多物质都能溶人水中。
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进入环境中的石油，由于生物学的和某些非生物学的机制(主要是光-化学氧化)而逐步降解。大量研究表明，在自然界净化石油污染的综合因素中，微生物降解起着重要作用。我国沈(阳)抚(顺)灌区20余万亩水稻田，主要以炼油厂含油废水灌溉，历时40余年，未发现石油显著积累和经常性的损害，主要是由于在石油污灌区形成的微生物生态系的降解作用。
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2. 脂肪烃的微生物降解机理
（1）能降解脂肪烃的微生物
许多微生物能氧化脂肪烃，见表7-4
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（2）链烷烃的微生物降解
1）微生物攻击链烷烃的末端甲基，由混合功能氧化酶催化，生成伯醇，再进一步氧化为醛和脂肪酸，脂肪酸接着通过β-氧化进一步代谢。反应式为：
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2）有些微生物攻击链烷烃的次末端，在链内的碳原子上插入氧。这样，首先生成仲醇，再进一步氧化，生成酮，酮再代谢为酯，酯键裂解生成伯醇和脂肪酸。醇接着继续氧化成醛、羧酸，羧酸则通过β-氧化进一步代谢。反应式如下：
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（3）脂环烃的微生物降解
能够利用脂环烃的微生物极少，而且活性弱，氧化能力差。其主要特征是脂环烃一般不能作为微生物所利用的碳源。在环境污染物中，用于脂环烃的有机物也比较少。一般降解过程是，脂环通过辅氧化作用，生成环醇、环酮，再氧化成ε-羟基-已酸，如果是脂环酸则氧化为庚二酸使环开裂，然后再通过β-氧化进一步降解。
如环已烷由混合功能氧化酶的羟化作用生成环已醇，后者脱氢生成酮，再进一步氧化，一个氧插入环而生内酯，内酯开环，一端的羟基被氧化成醛基，再氧化成羧基。反应式为：
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脂环化合物通常不能用作微生物生长的唯一碳源，除非它们有足够长的脂族侧链。虽然已发现能够在环已烷上生长的微生物，但更常见的是能转化环已烷为环已酮的微生物不能内酯化和开环，而能将环已酮内酯化和开环的微生物却不能转化环已烷为环已酮。可见微生物之间的互生关系和共代谢在环烷烃的生物降解中起着重要作用。
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（4）烯烃的微生物降解途径 　　
烯烃生物氧化途径研究得较多并已确认是末端烯烃。末端烯烃的氧化产物随初始进攻的位置(甲基或双键)而变化。可生成：ω-不饱和醇或脂肪酸；伯或仲醇或甲基酮；1，2-环氧化物； 1，2—二醇(图7-18)。
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3.芳香烃的微生物降解机理
芳香烃的种类极多，用途非常广泛，是一类很重要的有机化合物。微生物对芳香烃的作用也极复杂，一般也比较难降解。
（1）单环芳烃的微生物降解机理
苯是芳香烃中基础物质和基本骨架，也难被微生物降解，但研究较早。芳香烃被微生物降解的共同特点是首先生成邻苯二酚。然后有二条途径继续降解，其一是经β-己二烯二酸、尽酮己二酸生成琥珀酸和乙酰辅酶A；其二是经过α-羟基粘康酸半醛，最后生成乙酸和丙酮酸。微生物接受苯系化合物典型的方式就是利用氧分子作辅基，在双氧酶作用下，使苯环断裂。这些代谢物可以进入三羧酸循环再进一步代谢降解，如图7-19所示。
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甲苯、二甲苯是最简单的烷基苯，也是重要的化工原料，在环境污染物中是最常见的有机化合物。它们和其它的多甲基芳香烃类，都是比较艰被微生物降解的。它们在微生物作用下，先通过辅氧作用，其中一个甲基被氧化，而其余的甲基不被氧化；另一种情况则是先在苯环上导入羟基，然后再氧化成羧酸。
例如，甲苯和二甲苯在诺卡氏菌作用下降解途径如图7-20所示。
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（2）有侧链的芳香烃的降解
这类化合物种类很多，代谢降解比较复杂，以苯丙酸为例有两条代谢途径。其一是经安息香酸然后破坏；其二是经2，3-二羟苯丙酸然后破坏。如图7-21所示。
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有侧链的芳香烃有两种情况：奇数碳侧链和偶数碳侧链。
有奇数碳侧链的烷基苯，在微生物作用下，首先从侧链开始氧化。侧链的烷基按正烷烃的末端氧化形式进行氧化，生成奇数碳侧链的苯烷酸。再经β氧化，生成几个乙酰辅酶A和苯丙酸。例如
生成的苯丙酸的代谢降解同前。
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有偶数碳侧链的烷基苯，在微生物作用下，侧链烷基首先经末端氧化，生成有偶数碳侧链的苯烷酸，再经β氧化，生成苯乙酸和几个乙酰辅酶A。苯乙酸的代谢如下：
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（3）多环芳烃的微生物降解机理
多环芳烃的生物降解，先是一个环二羟基化、开环，进—步降解为丙酮酸和CO2，然后第二个环以同样方式分解。萘、菲、蒽的细菌氧化可用图7-22、7-23、7-24表示。
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（4）联苯的微生物降解
联苯的微生物降解首先是从联苯的芳环上开始的，(图7-25)。
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4.限制污染油生物降解的因素
影响微生物降解石油的因素有很多，油本身的毒性和抗性组分就限制了其生物降解，其他限制因子主要是温度、营养、供氧、油污的物理状态及降解菌的有无等。
海水温度低，影响烃类溶解和微生物分解，对海洋污染油的降解是一个重要的限制因子。无机营养尤其氮和磷不足，影响微生物生长和代谢活动，这可以通过补加营养得以解决。营养物要以可溶于油的形式补加。油浮于液面，使液面下环境缺氧，而石油的生物降解是需氧过程，故需通气充氧。初次发生油污染的水域或陆地，往往缺乏降解菌，需给以接种。
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降解石油烃化合物的微生物温度适应范围很广，既有嗜冷微生物，又有嗜热微生物，而主要的则是中温微生物，温度范围在0-70℃之间，这些微生物各自的温度适应范围是不可以改变的。
海洋环境、河口环境和淡水环境中生长着对不同盐度适应要求不同的微生物群落，这些微生物各自在相应的环境中可以取到较好的降解作用，但如果将它们所适应的环境进行改变，则可能导致降解活性的丧失。
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复习题
1. 什么是微生物降解？
2. 微生物对有机污染物有哪些降解作用？
3. 在评价微生物系统降解有机物质的能力时，有哪些系统动力学？
4. 试述卤代烃类有机物质微生物降解的生物化学机理。
5. 试述石油污染物微生物降解的生物化学机理。
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