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2.4蛋白质化学2.4.1蛋白质概述2.4.2氨基酸化学2.4.3蛋白质的分子结构2.4.4蛋白质的重要性质2.4.5蛋白质的分离提纯133第2章细胞内的生物分子化学2.4.1蛋白质概述蛋白质（Protein）普遍存在于一切生物体内，是生命的物质基础。它是由氨基酸通过肽键连接而成的生物高分子含氮化合物，其种类繁多，且各自具有复杂的分子结构和特定的生物学作用，是生物遗传性状表达的主要物质基础。蛋白质是自然界中一切生物体的重要组成成分。人体的蛋白质含量按总量干重计算占45％。自然界中蛋白质的种类极为繁多，据估计一个大肠杆菌内就有3000余种蛋白质，人体约含有数万种蛋白质，整个生物界大约存在着100亿种以上不同的蛋白质。由于这些种类繁多的蛋白质，并各自表现出千差万别的生物学功能，才使自然界中存在着种类繁多的各种生物体。134第2章细胞内的生物分子化学(1)结构功能蛋白质是人体高度结构化的物质基础,是构成细胞原生质的主要成分。如胶原蛋白是人体胶原纤维的主要成分，存在于皮肤、肌腱以及软骨和骨组织中，成为身体中起支持功能的主要物质。生物学作用(2)活性功能1.蛋白质的生物学作用135第2章细胞内的生物分子化学蛋白质与生命活动息息相关，没有蛋白质存在，就没有生命。蛋白质是维持细胞正常结构和机能活动的重要化学成分，在体内体现着生命活动中的多种生物学功能。5）防御功能生物机体产生的用以防御致病微生物或病毒的抗体（Antibody），就是一种高度专一的免疫蛋白(Immunoglobulin)，它能识别外源性生命物质，并与之接合，起到防御作用，免受伤害。6）凝血功能机体的止血功能是出许多凝血因子协同完成的。凝血因子中除Ca2+外，多属蛋白质类物质。4）运动功能肌肉的收缩运动是靠肌动蛋白(Actin)和肌球蛋白(Myosin)等来完成的 ，这是躯体运动、心肌收缩、胃肠蠕动及呼吸机能的基础。草履虫、绿眼虫的运动由纤毛和鞭毛完成，纤毛和鞭毛都是蛋白质。3）运输和储存功能一些蛋白质在血液中起运载工具的作用，如血红蛋白运输氧和二氧化碳，血浆脂蛋白是脂类的运输形式等。合成后的甲状腺素以甲状腺球蛋白的形式储存在腺泡腔内，肝脏内的铁蛋白复合物也是一种储存形式等。1）催化功能生命的基本特征是新陈代谢，而新陈代谢的全部化学反应，几乎都是在酶(Enzyme)的催化下进行的。酶的化学本质是蛋白质。2）调节功能生物体的一切生物化学反应能有条不紊的进行，是由于有调节蛋白在起作用，调节蛋白如激素（Hormone）、受体（Receptor）、毒蛋白（Toxoprotein）等。7）基因的调控功能核酸虽然是遗传的物质基础，但核酸的合成，遗传信息的储存、传递及表达都会受到蛋白质的调节和控制。136第2章细胞内的生物分子化学2.蛋白质的分类（1）按分子形状分类1）球状蛋白（Globular protein） 外形近似球体，多溶于水，大都具有活性，如酶、转运蛋白、蛋白激素、抗体等。球状蛋白的长度与直径之比一般小于10。2）纤维状蛋白(Fibrous protein )外形细长，分子量大，大都是结构蛋白，如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等。纤维蛋白按溶解性可分为可溶性纤维蛋白与不溶性纤维蛋白。如血液中的纤维蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等结构蛋白。137第2章细胞内的生物分子化学1）简单蛋白（simple proteins）完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。如血清清蛋白等。蛋白质2）结合蛋白(conjugated proteins)由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基(2)按分子组成分类结合蛋白分为：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。138第2章细胞内的生物分子化学根据溶解性为7类：清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白。（3）按溶解度分类1）清蛋白（albumins） 又称白蛋白，是溶于水的，如血清白蛋白、乳清白蛋白等。2）精蛋白(spermatins)溶于水及酸性溶液，含碱性氨基酸多，呈碱性，如鲑精蛋白。3）组蛋白(histones)溶于水及稀酸溶液，含碱性氨基酸较多，故呈碱性，它们常是细胞核染色质组成成分。4）球蛋白(albumins)微溶于水而溶于稀中性盐溶液，如血清球蛋白、肌球蛋白和大豆球蛋白等。5）谷蛋白(glutebins)不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱，如米、麦蛋白。6）醇溶蛋白(prolamines)不溶于水，溶于70%-80%乙醇，如玉米蛋白。7）硬蛋白(scleroproteins)不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液，如胶原蛋白，丝蛋白、毛发、蹄甲等角蛋白和弹性蛋白。139第2章细胞内的生物分子化学3.蛋白质的化学组成（1）元素组成所有的蛋白质都含有碳氢氧氮四种元素，有些蛋白质还含有硫、磷和一些金属元素。蛋白质平均含碳50％，氢7％，氧23％，氮16％。其中氮的含量较为恒定，这是蛋白质的一个特点。在糖和脂类中不含氮， 所以常通过测量样品中氮的含量来测定蛋白质含量。 如常用的凯氏(Kjedahl)定氮法:蛋白质含量＝ 蛋白氮×6.25,其中6.25是100/16,为一克氮所代表的蛋白质质量(克数).140第2章细胞内的生物分子化学(2)蛋白质的分子量141蛋白质(Protein)是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。蛋白质的分子量变化范围很大，从6000到100万或更大。这个范围是人为规定的。一般将分子量小于6000的称为肽(Peptide)。不过这个界限不是绝对的，如牛胰岛素分子量为5700，一般仍认为是蛋白质。蛋白质煮沸凝固，而肽不凝固。较大的蛋白质如烟草花叶病毒，分子量达4000万。某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质(Oligomerio protein)。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。例如烟草花叶病毒(TMV)，是由许多蛋白质亚基和核糖核酸组成的超分子复合物(Supramolecular complex)，“分子量”约为4×107。这些寡聚蛋白质或复合物虽然不是由共价键连接成的整体分子，而在一定条件下可以解离成它们的亚基，但是它们在生物体内是相当稳定的，可以从细胞或组织中以均一的甚至结晶的形式分离出来并且有一些蛋白质只有以这种寡聚蛋白质的形式存在，其活性才能得到或充分得到表现。第2章细胞内的生物分子化学对于那些不含辅基的简单蛋白质，用110除它的分子量即可约略估计其氨基酸残基的数目。蛋白质中20种氨基酸的平均分子量约为138，但在多数蛋白质中较小的氨基酸占优势。因此平均分子量接近128。又因每形成一个肽键将除去一分子水(分子量18)，所以氨基酸残基的平均分子量约为128—18＝110。表2—10中给出各种蛋白质的氨基酸残基数目 。142第2章细胞内的生物分子化学（3）蛋白质的水解蛋白质可以被酸、碱或蛋白酶催化水解，在水解过程中，逐渐降解成分子量越来越小的肽段（Peptide fragment）,直到最后成为氨基酸的混合物。根据蛋白质的水解程度，可分为完全水解和部分水解两种情况。完全水解或称彻底水解，得到的水解产物 是各种氨基酸的混合物。部分水解即不完全水解，得到得产物是各种大小不等的肽段和氨基酸。143第2章细胞内的生物分子化学蛋白质水解的三种方法：1）酸水解2）碱水解3）酶水解用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸，105℃回流20小时即可完全水解。酸水解不引起氨基酸的消旋作用（Racemization），得到的是L-氨基酸。缺点是色氨酸完全被破坏，丝氨酸和苏氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。用5mol/L的NaOH，水解10－20小时可水解完全。碱水解使氨基酸消旋，许多氨基酸被破坏，得到的产物是D型和L型氨基酸的混合物，称消旋物。碱水解引起精氨酸脱氨生成鸟氨酸和尿素。但色氨酸不被破坏，常用于测定色氨酸含量。酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。但酶水解时间长，反应不完全。一般用于部分水解，若要完全水解，需要用多种酶协同作用。常用的蛋白酶有胰蛋白酶（Trypsin）、糜蛋白酶(Ohymotrypsin)以及胃蛋白酶(Pepsin)等，它们主要用于蛋白质一级结构分析以获得蛋白质的部分水解产物。144第2章细胞内的生物分子化学2.4.2氨基酸化学1.氨基酸的结构氨基酸，顾名思义，它是含有氨基的酸，分子量低，具有下边的通用结构形式。天然氨基酸主要是α-氨基酸，β-氨基酸极少，如β-丙氨酸，存在于维生素泛酸(又名遍多酸)中。145第2章细胞内的生物分子化学除脯氮酸、羟脯氨酸分子略有特点（R基团同时与-C原于及氨基相连)外，所有氨基酸的通式为R—CH(NH2)-COOH，不同点在于它们的R基团不同(表2-12 )。由于氨基酸分子中有不对称C原子，它的构型有D-与L-系统之分。146第2章细胞内的生物分子化学147第2章细胞内的生物分子化学L-型氨基酸是自然界存在的主要形式，且仅L-型异构体参与任一个代谢反应(例外甚少)。某些氨基酸的旋光度见表2-11。2.氨基酸的分类蛋白质分子中存在的20种左右的氨基酸按R基因结构可分为脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环氨基酸三大类。在脂肪族氨基酸中，根据所含氨基、羧基的多寡及是否含硫或含羟基，又可分为中性(一氨基，一羧基)、酸性(一氨基，二羧基)、碱性(二氨基，一羧基)、含硫及含羟基氨基酸等几小类(表2-12 )。从营养学角度氨基酸可分为必需氨基酸和非必需氢基酸两类，前者是某种生命机体不能合成，或合成量少，不足以维持合适生长和氮平衡，必须由食物提供的，不同机体的必需氨基酸有所不同。后着是动物机体能自身合成的。148第2章细胞内的生物分子化学149第2章细胞内的生物分子化学150第2章细胞内的生物分子化学151第2章细胞内的生物分子化学3.氨基酸的重要性质（1）物理性质1）α-氨基酸都是无色晶体，熔点极高，一般在200 C以上。在水中的溶解度差别很大，除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不溶于有机溶剂。每种氨基酸都有特殊的结晶形状，可以用来鉴别各种氨基酸。脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。氨基酸有些味苦、有些味甜、有些无味，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。2）从α-氨基酸的结构通式可以看出，除甘氨酸外，其它α-氨基酸碳原子具有手性，因此具有旋光性。3）20种蛋白质氨基酸在可见光区域都无光吸收，在近紫外(220-300nm)区，侧链基团含有芳香环共轭双键系统的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸具有光吸收能力。其最大吸收分别在279、278nm和259nm波长处。蛋白质由于含有这些氨基酸，一般最大吸收在280 nm波长处，因此可以利用分光光度法方便地测定蛋白质的含量。152第2章细胞内的生物分子化学（2）α-氨基的反应1）与亚硝酸的反应氨基酸的α-氨基在室温下定量地与亚硝酸作用产生羟基羧酸和N2，所生成的N2可用气体分析仪器加以测定,这是Van Slyke氏氨基氮测定法的原理。α-NH2作用3—4分钟即反应完全。除α-NH2外,赖氨酸的δ-NH2也能与亚硝酸反应但速度较慢。153第2章细胞内的生物分子化学2）与醛的反应氨基酸的α-氨基能与醛类物质反应，生成西佛碱。这是引起食物褐变的反应之一。食物中的氨基酸与葡萄糖醛基发生所谓羰氨反应，生成西佛碱，进一步转变成有色物质，这是非酶促褐变的一种机制。154第2章细胞内的生物分子化学3）酰基化与羟基化反应氨基酸氨基的一个H可被酰化试剂（如酰氯或酸酐）或羟基化试剂（如2,4-二硝基氟苯(DNFB)）在弱碱性溶液中取代，氨基即被酰基化或羟基化。① 苄氧甲酰氯反应:155第2章细胞内的生物分子化学156第2章细胞内的生物分子化学4）脱氨反应在转氨酶的催化下，氨基酸可脱去氨基，变成相应的酮酸。这一反应是生物体内氨基酸分解代谢的重要方式之一。157第2章细胞内的生物分子化学（3）α-羧基的反应1）成盐和成酯反应氨基酸与碱作用即生成盐，例如与氢氧化钠反应得氨基酸钠盐，其中重金属盐不溶于水。氨基酸的羧基被醇酯化后，形成相应的酯。例如氨基酸在无水乙醇中通入干燥氯化氢气体或加入二氯亚砜，然后回流，生成氨基酸乙酯的盐酸盐。氨基酸酯是制备氨基酸的酰胺或酰肼的中间物。158第2章细胞内的生物分子化学当氨基酸的羧基变成甲酯、乙酯或钠盐后，羧基的化学反应性能即被掩蔽或者说羧基被保，而氨基的化学反应性能得到加强或说氨基被活化，容易和酰基或烃基结合，这就是为什么氢基酸的酰基化和烃基化需要在碱性溶液中进行的原因。2）酰氯化反应氯基酸的氨基如果用适当的保护基，例如苄氧甲酰基保护后，其羧基可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯：这个反应可使氨基酸的羧基活化，使它容易与另一氨基孩的氨基结合，因此在多肽人工合成中是常用的。159第2章细胞内的生物分子化学3）脱羧基反应在生物体内氨基酸经氨基酸脱羧酶作用，放出二氧化碳并生成相应的一级胺：4）叠氮反应氨基酸的氨基通过酰化加以保护，羧基经酯化转变为甲酯，然后与肼和亚硝酸反应即变成叠氮化合物。此反应使氨基酸的羧基活化。氨基酸叠氮化合物常用于肽的人工合成。160第2章细胞内的生物分子化学（4）α-氨基和α-羧基共同参加的反应1）氨基酸的两性解离与等电点氨基酸的同一分子中含有氨基和羧基，是两性电解质，在水溶液或结晶内基本上均以兼性离子或偶极离子的形式存在。氨基酸的兼性离子在酸性溶液中可接受质子形成阳离子，在碱性溶液中则释放质子形成阴离子。以甘氨酸为例：式中K1`和K2`分别代表α-碳原子上-COOH和-NH3+的表观解离常数161第2章细胞内的生物分子化学通常可用酸和碱分别滴定氨基酸，根据滴定曲线求得pK1`和pK2’，例如1mol甘氨酸溶于水时，溶液pH为5.97，分别用标准NaOH和HCl滴定，以溶液pH为纵坐标，加入HCl和NaOH的moI数为横坐标作图，得到滴定曲线(图2—17)：162第2章细胞内的生物分子化学甘氨酸的滴定曲线十分重要的特点就是在pH2．34和pH9．60处有两个“拐点”，分别为其pK1`和pK2`。可以看出氨基酸的解离状态与溶液的pH值有关：当PH＜1时，甘氨酸基本上以质子化的阳离子形式(R+)存在，随着pH值增大，[R+]减小，[R]增加，pH= pK1时[R+]=[R]；pH＝5．97时，甘氨酸基本上以兼性离子的形式(R)存在，或者少量的R+与R-浓度相等，氨基酸的净电荷为零，这个pH值称为等电点(isoelectric，pI)；溶液的pH值继续增大，[R]逐渐减小，[R-]顺之增大，当pH＝pK2‘时，[R]＝[R-]；PH＞12时，甘氨酸则全部以阴离子(R-)的形式存在。各种氨基酸的pK’和pI值见表2-13。163第2章细胞内的生物分子化学164氨基酸的两性解离是其最重要的性质。各解离基团的pK值也十分重要，据此可以计算出任一pH条件下氨基酸各种解离形成的相对浓度及其pI值。第2章细胞内的生物分子化学2）茚三酮反应在氨基酸的分析化学中，具有特殊意义的是氨基酸与茚三酮（ninhydrin）的反应。茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物-氨和还原茚三酮发生作用，生成紫色物质。其反应如下：165第2章细胞内的生物分子化学用纸层析或柱层析把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性或定量测定各种氨基酸。定量释放的CO2可用测压法测量，从而计算出参加反应的氨基酸量。两个亚氨基酸——脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应并不释放NH3、而直接生成黄色化合物其结构式如下所示：166第2章细胞内的生物分子化学3）成肽反应一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以缩合成肽，形成的键称肽键。例如甘氨酸在乙二醇中加热缩合，生成二酮吡嗪或称甘氨酸酐。167第2章细胞内的生物分子化学多个氨基酸可按此反应方式生成长链状的肽化合物。（5）侧链R基参加的反应氨基酸侧链具有功能团时也能发生化学反应。这些功能团有羟基、酚基，巯基(包括二硫键)，吲哚基，咪唑基，胍基、甲硫基以及非α-氨基和非α-羧基等。每种功能团都可以和多种试剂起反应。部分侧链基团的显色反应见表2-14。168第2章细胞内的生物分子化学2.4.3蛋白质的分子结构蛋白质是由20种左右的氨基酸借肽键连接形成的生物大分子。每种蛋白质都有自己的氨基酸组成及排列顺序，同时具有特定的空间结构。这些特性构成了蛋白质独特生理功能的结构基础。理论上分析，组成蛋白质大分子的氨基酸种类、数目、排列顺序及空间结构的不同所产生的古中蛋白质几乎十无穷无尽的，为生物体行使千差万别的功能需要提供了物质基础。蛋白质分子结构由低层到高层可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个层次，后三者统称为空间结构、高级结构或空间构象。蛋白质的空间结构涵盖了蛋白质分子中的每一原子在三维空间的相对位置，它们是蛋白质特有性质和功能的结构基础。169第2章细胞内的生物分子化学1.蛋白质的一级结构一级结构（Primary structure）也称初级结构，是指氨基酸如何连接成肽以及氨基酸在肽链中的排列顺序。（1）肽链中氨基酸的基本连接方式肽链中氨基酸间的连接是一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合失去一分子水形成共价键，称为肽键（Peptide bond）而成。例如两分子甘氨酸脱去1分子的水后形成甘氨酰甘氨酸，生成肽键，反应继续进行，可生成含有许多氨基酸残基的多肽。170第2章细胞内的生物分子化学最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽(dipeptide)其中包含一个肽键。含有三、四、五个氨基酸的肽分别称为三肽、四肽、五肽等。肽链中的氨基酸由于形成肽键时脱水，已不是完整的氨基酸，所以称为氨基酸残基（amino acid residne）。多肽链中每一个氨基酸单位在形成肽键时丢失一分子水。严格地说每形成一个肽键丢失一分子水，因此丢失的水分子数应比氨基酸残基数少一个。一条多肽链通常在一端含有一个游离的末端氨基，在另一端含有一个游离的末端羧基。这两个游离的末端基团有时连接而成环状肽(cyclic peptide)。肽的命名是根据组成肽的氨基酸残基来确定的。一般从肽的氨基端开始，称为某氨基酰某氨基酰-某氨基酸。肽的书写也是从氨基端开始。171第2章细胞内的生物分子化学172例如，具有下列化学结构的五肽命名为丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸，简写为Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu。应指出，肽链也象氨基酸一样具有极性，通常总是把NH2末端氮基酸残基放在左边，COOH末端氨基酸残基放在右边，除特别指明者外。上面举例的五肽丝氨酸残基侧为NH2末端 亮氨酸残基侧为COOH末端。注意，反过来书写的Leu—A1a—Tyr—G1y—Ser是一个不同的五肽。第2章细胞内的生物分子化学（2）肽链中氨基酸的排列顺序蛋白质的种类和生物活性皆与肽链的氨基酸排列次序有关。蛋白质一级结构测定就是氨基酸排列顺序测定。一般是用两种以上专—性水解方法，分别将肽链切断，各自得到大小不同的肽段．然后将这些肽段分离提纯，测定它们的氨基酸排列顺序，得到的两套肽段的氨基酸排列顺序拼接起来，就可得到该蛋白质肽链的一级结构即全部氨基酸排列顺序。测定蛋白质一级结构的步骤虽然繁多，但方法并不复杂。(a)提纯蛋白质样品；(b)测定分子量和氨基酸组成；(c)测定肽链末端的氨基酸；(d)折开二硫键，得伸展的肽链。如有几条链，则把它们分开；(e)用化学和酶法，把肽链进行专—性水解，得到分子量大小不等的一系列肽段；(f)分离提纯这些肽段，并测定各个肽段的氨基酸排列顺序；对一些大的肽段还需要两种以上专—性水解法，得到几套小肽段，分别测定它们的氨基酸排列顺序，最后把所得到全部结果，联合起来拼揍，就可排出肽链的氨基酸顺序。173第2章细胞内的生物分子化学得到分子量大小不等的肽段如有几条链，则把它们分开肽链进行专—性水解折开二硫键，得伸展的肽链测定肽链末端的氨基酸测定分子量和氨基酸组成分离提纯这些肽段提纯蛋白质样品测定蛋白质一级结构的步骤各个肽段的氨基酸排列顺序174第2章细胞内的生物分子化学2.蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构是指肽链主链的空间走向（折叠和盘绕方式），是有规则重复的构象。肽链主链具有重复结构，其中氨基是氢键供体，羰基是氢键受体。通过形成链内或链间氢键可以使肽链卷曲折叠形成各种二级结构单元。复杂的蛋白质分子结构，就由这些比较简单的二级结构单元进一步组合而成。（1）α螺旋(α-helix)α螺旋模型是Pauling和Corey等研究α-角蛋白时于1951年提出的。α-螺旋结构如图2—18所示。175第2章细胞内的生物分子化学176其要点如下：多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm。肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。蛋白质分子为右手 -螺旋。第2章细胞内的生物分子化学（2）β-折叠（β-pleated sheet）β-折叠也叫β-片层，是一种肽链相当伸展的结构，这种结构除了纤维状蛋白质中有，也存在于球状蛋白质中，在这种结构中肽链按层排列，它依靠相邻的肽链上的 与 形成氢键以维持其结构的稳定性。如图2—19。177其要点如下： -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。在 -折叠中， -碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm。 -折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的，也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。 -折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。第2章细胞内的生物分子化学3.蛋白质的三级结构蛋白质分子在二级结构的基础上进一步卷曲折叠，构成一个很不规则的具有特定构象的蛋白分子。这种由 -螺旋， -折叠等二级结构之间互相配置而构成的构象称为三级结构。哺乳动物肌肉中的肌红蛋白整个分子由一条肽链盘绕成一个中空的球状结构，全链共有8段α螺旋，各段之间以无规卷曲相连。在α螺旋肽段间的空穴中有一个血红素基（图2-20）178第2章细胞内的生物分子化学其要点如下：蛋白质的三级结构是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。蛋白质三级结构的形成和稳定主要依靠次级键——疏水键、离子键（盐键）、氢键和范德华力等。在三级结构中，多肽链的盘曲折叠是由分子中各氨基酸残基的侧链相互作用来维持的。二硫键是维持三级结构唯一的一种共价键，能把肽链的不同区段牢固地连接在一起，而疏水性较强的氨基酸则借疏水力和范德华力聚集成紧密的疏水核，有极性的残基以氢键和盐键相结合。在水溶性蛋白中，极性基团分布在外侧，与水形成氢键，使蛋白溶于水。这些非共价键虽然较微弱，但数目庞大，因此仍然是维持三级结构的主要力量。179第2章细胞内的生物分子化学4.蛋白质的四级结构由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链聚合而成特定的构象的蛋白质分子叫蛋白质的四级结构，其中每一条多肽链称为亚基，每个亚基都有自己的一、二、三级结构。亚基单独存在时无生物活性，只有相互聚合成特定构象时才具有完整的生物活性。最简单的寡聚蛋白是血红蛋白。它是由两条α链和两条β链构成的四聚体（图2-22），分子量65000。分子外形近似球状，每个亚基都和肌红蛋白类似。血红蛋白与氧结合时，α和β链都发生了转动，引起四个亚基间的接触点上的变化。两个α亚基相互接近，两个β亚基则离开。血红素结构如图2-23所示。180第2章细胞内的生物分子化学181第2章细胞内的生物分子化学2.4.4蛋白质的重要性质蛋白质是由氨基酸组成的，它的理化性质与氨基酸的性质有些相似，但是，多种氨基酸构成蛋白质，从量变到质变，与氨基酸已有质的区别，因而表现出一些特有的性质。1.蛋白质的分子量蛋白质是分子量很大的生物大分子．分子量—般在10000000(道尔顿)之间。如表2-15所示。182第2章细胞内的生物分子化学蛋白质的分子量测定的主要方法有渗透压法、超速离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。更常用的是凝胶过滤法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法。以上方法所测定的蛋白质分子量都有一定误差，可选择几种不同方法测定后进行比较，计算出较可靠的分子量数值。蛋白质(包括核酸)分子量常用S表示，这是超速离心法测定结果的一种表示学位，它是指单位离心场强度的沉降速度，称沉降系数。一个S单位为1×l013s，S值随分子量增大而增大。183第2章细胞内的生物分子化学2.蛋白质的酸碱性蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点,表2-16是几种蛋白质的等电点 。184第2章细胞内的生物分子化学蛋白质在等电点(Isoelectric point)时净电荷为零，因此没有同种电荷的排斥，所以不稳定，溶解度最小，易聚集沉淀。同时其粘度、渗透性、膨胀性以及导电能力均为最小。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis) ,可用电泳来分离提纯蛋白质。3.蛋白质的胶体性质蛋白质是大分子，在水溶液中的颗粒直径在1－100纳米之间，是一种分子胶体，具有胶体溶液的性质，如布朗运动、丁达尔现象、电泳、不能透过半透膜及吸附能力等。蛋白质形成的胶体颗粒在溶液中是相当稳定的，因为它具有两个因素：一是蛋白质颗粒在一定的pH条件下带有相同的电荷，因而颗粒之有静电排斥力；二是蛋白质颗粒表面具有很多极性基团，可以极性水分子缔合，形成所谓水膜层。由于这两种因素，阻止了蛋白质颗粒相互凝聚下沉的作用，见图2-24。185第2章细胞内的生物分子化学利用半透膜如玻璃纸、火胶棉、羊皮纸等可分离纯化蛋白质，称为透析。蛋白质有较大的表面积，对许多物质有吸附能力。多数球状蛋白表面分布有很多极性基团，亲水性强，易吸附水分子，形成水化层，使蛋白溶于水，又可隔离蛋白，使其不易沉淀。一般每克蛋白可吸附0.3到0.5克水。分子表面的可解离基团带相同电荷时，可与周围的反离子构成稳定的双电层，增加蛋白质的稳定性。蛋白质能形成稳定胶体的另一个原因是不在等电点时具有同种电荷，互相排斥。因此在等电点时易沉淀。186第2章细胞内的生物分子化学4.蛋白质的沉淀反应蛋白质由于带电荷和水膜，因此在水溶液中是稳定的胶体。如在蛋白质溶液中加入适当的试剂，就破坏了蛋白质水化膜并中和掉它的电荷、则蛋白质溶液就不稳定而出现沉淀。（1）盐析法向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。（2）有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(甲醇、乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。有机溶剂沉淀法，如果控制在低温下操作并且尽量缩短处理时间则可使变性速度减慢。187第2章细胞内的生物分子化学（3）重金属盐沉淀法当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子(Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等)结成不溶性盐而沉淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐，后者再服用催吐剂排出体外。188第2章细胞内的生物分子化学（4）生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如鞣酸或称单宁酸，苦味酸即2，4，6—三硝基酚，钨酸和碘化钾等。某些酸类指的是三氯醋酸，磺酰水杨酸和硝酸等。当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干扰测定的蛋白质。189第2章细胞内的生物分子化学（5）加热变性沉淀法几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。190第2章细胞内的生物分子化学5.蛋白质的变性天然蛋白因受物理或化学因素影响，高级结构遭到破坏，致使其理化性质和生物功能发生改变，但并不导致一级结构的改变，这种现象称为变性，变性后的蛋白称为变性蛋白(denatured protein)。二硫键的改变引起的失活可看作变性。能使蛋白变性的因素很多，如强酸、强碱、重金属盐、尿素、胍、去污剂、三氯乙酸、有机溶剂、高温、射线、超声波、剧烈振荡或搅拌等。但不同蛋白对各种因素的敏感性不同。蛋白质变性后分子性质改变，粘度升高，溶解度降低，结晶能力丧失，旋光度和红外、紫外光谱均发生变化。变性蛋白易被水解，即消化率上升。同时包埋在分子内部的可反应基团暴露出来，反应性增加。蛋白质变性后失去生物活性，抗原性也发生改变。191第2章细胞内的生物分子化学192这些变化的原因主要是高级结构的改变。氢键等次级键被破坏，肽链松散，变为无规卷曲。由于其一级结构不变，所以如果变性条件不是过于剧烈，在适当条件下还可以恢复功能。如胃蛋白酶加热至80－90℃时，失去活性，降温至37℃，又可恢复活力，称为复性（Renaturation）。但随着变性时间的增加，条件加剧、变性程度也加深，就达到不可逆的变性。变性现象也可加以利用，如用酒精消毒，就是利用乙醇的变性作用来杀菌。在提纯蛋白时，可用变性剂除去一些易变性的杂蛋白。工业上将大豆蛋白变性，使它成为纤维状，就是人造肉。第2章细胞内的生物分子化学6.蛋白质的颜色反应（1）双缩脲反应双缩脲是有两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180℃，则两分子尿素缩合，放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应生成红紫色络合物，称为双缩脲反应。蛋白质中的肽键与之类似，也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。此反应可用于定性鉴定，也可在540nm比色，定量测定蛋白含量。（2）黄色反应含有芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的蛋白质在溶液中遇到硝酸后，先产生白色沉淀，加热则变黄，再加碱颜色加深为橙黄色。这是因为苯环被硝化，产生硝基苯衍生物。皮肤、毛发、指甲遇浓硝酸都会变黄。（3）米伦反应米伦试剂是硝酸汞、亚硝酸汞硝酸和亚硝酸的混合物，蛋白质加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸及含酪氨酸的化合物都有此反应。193第2章细胞内的生物分子化学（4）乙醛酸反应在蛋白溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有此反应。不含色氨酸的白明胶就无此反应。（5）坂口反应精氨酸的胍基能与次氯酸钠（或次溴酸钠）及α萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质。此反应可用来鉴定含精氨酸的蛋白质，也可定量测定精氨酸含量。（6）费林反应（Folin-酚）酪氨酸的酚基能还原费林试剂中的磷钼酸及磷钨酸，生成蓝色化合物。可用来定量测定蛋白含量。它是双缩脲反应的发展，灵敏度高。194第2章细胞内的生物分子化学2.4.5蛋白质的分离提纯1.选材及预处理（1）选材主要原则是原料易得，蛋白含量高。蛋白质的主要来源包括动物、植物和微生物。由于种属差异及培养条件和时间的差别，其蛋白含量可相差很大。植物细胞含纤维素，坚韧，不易破碎，且多含酚类物质，易氧化产生有色物质，难以除去。其液泡中常含有酸性代谢物，会改变溶液的pH。微生物因为容易培养而常用，但也需要破碎细胞壁。动物细胞易处理，但不经济。（2）细胞破碎如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白释放出来。动物细胞可用匀浆器、组织捣碎机、超声波、丙酮干粉等方法破碎。植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。有超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法。（3）抽提一般用缓冲液保持pH。可溶蛋白常用稀盐提取，如0.1Mol/L NaCl。脂蛋白可用稀SDS或有机溶剂抽提，不溶蛋白用稀碱处理。抽提的原则是少量多次。要注意防止植物细胞液泡中的代谢物改变pH，可加入碱中和；为防止酚类氧化可加5mMol/L维生素C。加DFP或碘乙酸可抑制蛋白酶活力，防止蛋白被水解。195第2章细胞内的生物分子化学2.粗提主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。常用以下方法：（1）沉淀法1） 核酸沉淀剂：MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素、核酸酶等2） 蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、SDS等，也可除多糖，沉淀后应迅速盐析除去沉淀剂，以免目的蛋白变性。3）选择变性：用加热、调节pH或变性剂选择性地变性杂蛋白。如提取胰蛋白酶或细胞色素C时，因其稳定性高，可用2.5％三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。（2）分级法常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白。196第2章细胞内的生物分子化学（3）除盐和浓缩盐析后样品中含大量盐类，应透析除去。也可用分子筛，如Saphadex G25层析除盐。如样品过稀，可用反透析、冻干、超滤等方法浓缩 。3.精制以上方法得到的制剂可供工业应用。如需高纯样品，应精制。常用方法有各种层析、电泳、等电聚焦、结晶等。蛋白结晶不等于无杂质，但变性蛋白不能结晶，所以可说明其具有生物活性。197第2章细胞内的生物分子化学

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