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3. 新陈代谢催化剂酶化学
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3.4 酶促反应的动力学
酶促反应动力学(Kinetics of enzyme-catalyzed reactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。
酶促反应速度指的是反应初速度，此时反应速度与酶的浓度呈正比关系，避免反应产物以及其他因素的影响。
第3章 新陈代谢催化剂酶化学
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酶的结构与功能关系、作用机理
的研究需要动力学的实验数据
了解酶在代谢中的作用
和了解污染物降解的作用机理
需要掌握酶促反应的速度规律
原因
酶促反应动力学的研究重要意义：
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3.4.1 酶促反应的速度
结论：
不同时间的反应速度就是时间为不同值时曲线的斜率
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不同时间测定反应体系中产物的生成量，以产物的生成量对时间作图，可得到如图3—6的反应进程曲线。
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随着酶反应时间的增加
底物浓度降低
产物不断积累
部分酶失活
只有在反应的初始阶段，上述因素的影响才可忽略不计 。
导致
酶反应速度
下降
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研究酶反应速度通常都以反应的初速度为准。
通常以酶反应过程曲线的直线部分来计算酶反应的初速度
酶反应的初速度愈大，说明酶的催化活力愈高
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3.4.2 影响酶促反应速度因素
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1.酶浓度对反应速度的影响
当底物浓度大大超过酶的浓度即[S] [E]时，酶的浓度与反应速度呈正比关系(图3-7)。其关系式为v＝K[E]，其中K是比例常数。
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酶和底物是构成酶反应系统最基本的因素，它们决定了酶反应的基本性质，其他各种因素必须通过它们才能产生影响，因此，酶和底物之间的动力学关系是整个酶反应动力学的基础。
实验发现随着底物浓度的增加，反应速度的上升呈双曲线，即在低浓度时，反应速度υ与底物浓度cs呈正比，表现为一级反应。如果底物浓度很大时，反应速度逐渐接近恒定值(最大反应速度)而与底物浓度无关，表现为零级反应。典型的酶反应速度曲线如图3—8 所示。
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2.底物浓度对反应速度的影响
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（1）米氏方程的导出
解释上述现象可用中间络合物学说，即
1923年Michaelisl论和Menten根据这一假设，对酶催化反应进行了动力学分析．推导著名的米氏方程。
反应产物P的生成速度决定于中间络合物ES的分解速度，即
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根据稳态原理，中间物ES的浓度开始由零逐渐增加到一定数值后到动态平衡(稳态)，此时ES的生成速度等于其分解速度，即
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式(３-７) 就是酶催化反应的米氏方程，简称Ｍ-Ｍ 方程。
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(2)米氏方程参数的确定
动力学参数一般都是根据动力学实验求得。
通过实验数据拟合出米氏方程中的υmax及Km
在cE0一定的条件下，改变底物浓度cS，测量反应速度υ，以υ对cS作图，如图3—9所示。当cS根大，反应速度趋于一个极限值，这个值就是υmax，而在υ＝1/2υmax处有
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由于根据实验点很难拟合出误差最小的曲线(底物浓度cS很高时．通常很难测定υmax的渐近值)，故得到的Km不易准确，因此，往往要进行线性化处理。这里仅介绍比较常用的双倒数作图法。
将米氏方程两边取倒数可得下列形式
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2)提供了一个极为重要的酶催化反应的动力学参数Km
通过Km表达了酶催化反应的性质、反应条件和酶催化反应速度之间的关系(Km是各速度常数的函数，而各速度常数又决定于反应性质、反应条件)。
Km是酶的特征常数，酶不同，Km值不同，一般在～1之间。如一种酶能与多种底物作用，则每种底物有一特定的Km值。其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物(Optimum substrate)或天然底物。不同底物有不同的Km值这一点说明同一种酶对不同底物的亲和力不同。一般近似地以1／Km来表示亲和力。Km值愈小，1／Km则大，表明亲和力大，酶催化反应易于进行。
3)反映了酶反应速度与酶浓度间的关系
由米式方程可知．当cS》Km时，υ＝k2cE0具有线性关系，即反应速度与酶浓度成正比。这是一个重要而实用的结论。在测定酶活性时一般选择此条件，此时，酶活力正比于酶浓度而与底物浓度无关。
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当温度升高时
反应速度加快，其温度系数为l～2
温度对酶催化反应速度的影响包括两方面
随着温度的升高而使酶蛋白逐步变性，反应速度随之下降 (见图3-11)
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3.温度对酶催化反应速度的影响
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酶反应的最适温度是这两种过程平衡的结果。
大多数酶的最适温度在30～60℃之间，少数酶能耐受较高的温度。
如细菌淀粉酶在93℃活力最高，牛胰核糖核酸酶加热到100℃仍不失活。
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4.pH值对酶催化反应速度的影响
大多数酶的活性受pH值影响较大。
在极端的情况下(强酸或强碱)会导致蛋白质的变性．使酶永远失活。
在一般情况下，由于酶蛋白质的两性特性，两在任何pH值中部可能同时含有带正电荷或负电荷的基团，这种可离子化的基团常常是酶活性部位的一部分。为了完成催化作用．酶必须以一种特定的离子化状态存在，这就要求系统应具有与之相适应的pH值。在一定条件下，能使酶发挥最大活力的pH值称为酶的最适pH值。大多数酶的最适pH值在5—8之间，但也有例外，如胃蛋白面的最适pH值为1.5，肝中的精氨酸酶的最适pH值为9.7，胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH值活性曲线如图3—12所示。
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5.激活剂对酶催化反应速度的影响
凡能提高酶的活性、加速两催化反应进行的物质都称为激活剂或活化剂(activator)。
如Co2+、Mg2+、Mn2+等金属离子可显著增加D—葡萄糖异构酶的活性；Cu2+、Mn2+、Al3+三种金属离子对黑曲霉酸性蛋白酶有协同激活作用，若三者同时加入酶活性可提高两倍。
一般认为，这里金属离子的激活作用是金属离子使底物更有利于同酶的活性部位相结合而加速反应进行，金属离子在其中起了搭桥作用。有些酶的激活剂是无机阴离子及诸如半肮氨酸、维生素C等小分子有机化合物。
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图3-13 竞争性抑制作用特点
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6.抑制剂对酶催化反应速度的影响
酶在不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起酶活性的降低或丧失，称为抑制作用(Inhibition)。引起抑制作用的物质称为抑制剂(Inhibitor)，抑制剂可能是外来物，也可能是反应产物(产物抑制)或底物(底物抑制)。
在酶催化反应中抑制作用相当普遍，是酶催化与非酶催化反应之间一个重要的区别。生物体内新陈代谢过程之所以能如此有条不紊地进行．均得归功于酶的这一特性，即是抑制剂在生物体内起到了调节、控制代谢速率的作用。
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酶的抑制作用可以是不可逆的，也可以是可逆的。不可逆抑制作用（Irreverisible inhibition）通常是抑制剂以共价键与酶蛋白中的必需基团结合，结合较牢固(不能用透析、超滤等方法除去)，逐步使酶活性丧失而不能恢复。例如，常用的有机磷农药，他们能与害虫体内的乙酰胆碱醋酶的丝氨酸的—OH基结合而使酶的活性丧失，导致神经中毒死亡。可逆抑制作用(Reversible inhibition)是指抑制剂与酶蛋白以非共价链结合，具有可逆性，可以通过加入某些能解除抑制的物质而恢复酶的活力。此处将重点介绍可逆抑制。根据抑制剂与底物的关系，可逆抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制和反竞争抑制等。
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（1）竞争性抑制（comprtitive inhibition）
抑制剂可与酶的活性中心，与底物竞争，阻止底物与酶的结合，降低酶反应速度（图 3-13）。
可以通过增加底物浓度解除这种抑制作用。
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酶不能同时与底物（S）、抑制剂（I）结合，所以，有ES，有EI，而没有ESI，故
式中，cEf为游离酶浓度，cE为酶的总浓度。
根据米-门学说原理，可导出
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竞争性抑制物往往代化学结构上与底物相似，因而能与底物相互竞争，在酶的同一活件部位结合而产生抑制作用。典型的例子是丙二酸(或戊二酸)对丁二酸(琥泊酸)脱氢酶的抑制作用。丙二酸像丁二酸一样有两个可与活性中心相结合的羧基。但却没有两个可失去H而形成双键的亚甲基，因此，不能进行下列只有丁二酸才能进行的脱氢反应
当丙二酸与丁二酸的浓度比为1：50时，酶活力被抑制50％。若增大丁二酸浓度，则抑制作用减弱，若增大丙二酸浓度，则抑制作用加强。
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（2）非竞争性抑制(noncompetitive inhibition)
在非竞争性抑制作用中，酶可以同时与底物及抑制剂结合，两者没有竞争作用。
但中间产物ESI不能进一步分解成产物，因此酶活性降低。这类抑制剂与酶活性中心以外的基团相结合（图3-15）。
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酶与底物结合后，可再与抑制剂结合；酶与抑制剂结合后，也可以再与底物结合。所以这种抑制有ES、EI、及EIS（EIS=ESI），故
非竞争性抑制作用曲线如图3-16所示。
增加底物浓度不能解除这种非竞争性抑制作用，因此反应的υmax减小。由于非竞争性抑制作用不改变酶与底物的亲和力，因此，Km不变。
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这类抑制物的结构与底物并不相像，如亮氨酸是精氨酸酶的非竞争性抑制物．亮氨酸与稻氨酸的结构并不相像。乙酸、丙酸及乳酸等有机酸常对—些水解酶发生非竞争性抑制作用。
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（3）反竞争抑制（uncompetitive inhibition）
酶与底物结合后才能与抑制剂结合，复合物不能生成产物。反竞争性抑制剂使Km和υmax都变小。这种抑制存在着以下的平衡：
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将无抑制剂和有抑制剂各种情况下的最大酶促反应速度与Km值归纳于表3-8中：
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3.5酶活力测定
酶活力（Enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
检查酶的含量及存在，不能直接用重量或体积来表示，常用它催化某一特定反应的能力来表示，即用酶的活力来表示。酶活力的高低是研究酶的特性、进行酶制剂的生产及应用时的一项必不可少的指标。
1.酶活力与酶反应速度
酶活力的大小可以用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速度(Reaotion veloeity或Reaetion rate)来表示，即酶催化的反应速度愈快，酶的活力就愈高，速度愈慢，的的活力就愈低。所以测定酶的活力(实质上就是酶的定量测定)就是测定酶促反应的速度(用υ表示)。
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酶反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，所以反应速度的单位是：浓度／单位时间。
将产物浓度对反应时间作图，反应速度即图3-18中曲线的斜率。从图中可知，反应速度只在最初—段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。引起下降的原多，如底物浓度的降低，酶在一定的pH及温度下部分失活，产物对酶的抑制、产物浓度增加而加速了逆反应的进行等。因此，研究酶反应速度应以酶促反应的初速度为准。这时上述各种干扰因素尚未起作用，速度保持恒定不变。
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测定产物增加量或底物减少量的方法很多，常用的方法有化学滴定、比色、比旋光度、气体测压、测定紫外吸收、电化学法、荧光测定以及同位素技术等。选择哪一种方法，要根据底物或产物的物理化学性质而定。在简单的酶反应中．底物减少与产物增加的速度是相等的，但一般以测定产物为好，因为测定反应速定时，实验设计规定的底物浓度往往是过量的，反应时底物减少的量只占其总量的一个极小部分，测定时不易准确；而产物则从无到有，只要方法足够灵敏，就可以准确测定。
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2.酶的活力单位
酶的活力大小，也就是酶量的大小，用酶的活力单位(U，Active unit)来度量。
196l年国际酶学会议规定：1个酶活力单位，是指在特定条件下，在1分钟内能转化l微摩尔(μmol)底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。特定条体：温度选定为25℃，其他条件(如pH及底物浓度)均采用最适条件。这是一个统一的标准但使用起来不如习惯用法方便。
被人们普遍采纳的习惯用法使用较方便。例如，α-淀粉酶，可用每小时催化l克可溶性淀粉液化所需要的酶量来表示，也可以用每小时催化1毫升2%可溶性淀粉液化所需要的酶量作为一个酶单位不过这些表示法不够严格，同一种酶有好几种不同的单位，也不便了对酶活力进行比较。
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3.酶的比活力
比活力(Specific activity)的大小，也就是酶含量的大小，即每毫克酶蛋白所具有的酶活力，一般用单位／毫克蛋白(U／mg蛋白质)来表示。也有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示(单位／克或单位／毫升)。它是酶学研究及生产中经常使用的数据，可以用来比较每单位重量酶蛋白的催化能力。对同—种酶来说，比活力愈高，表明酶愈纯。
4.酶的转换数
转换数kcat为每秒钟每个酶分子，转换底物的微摩尔数(μmol)。它相当于一旦产物-酶(ES)中间物形成后，酶将底物转换为产物的效率。在数值上kcat＝k3，此处的k3即米氏方程导出部分中的k3，是由ES形成产物的速度常数，例如表3-9。
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复习题
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