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(共50张PPT)
1982年2月5日，著名学术期刊《科学》发表了科学家运用基因工程技术使大肠杆菌合成人胰岛素的研究成果。此项基因工程技术经过完善，最终实现了大肠杆菌能够在装有培养液的发酵罐中大量生产人胰岛素，再经加工制成药品。通过基因工程获得的人胰岛素不仅价格低廉，而且疗效好，拯救了大批糖尿病患者。
运用转基因大肠杆菌生产人胰岛素
那么，什么是基因工程？
科学家是如何完成上述过程的呢？
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第四章 基因工程
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第一节　基因工程赋予生物新的遗传特性
第1课时　基因工程的工具与DNA的粗提取和鉴定
目 录
基因工程的概念、诞生的理论基础
基因工程重要工具
活动:DNA的粗提取和鉴定
转基因大肠杆菌的简要过程
普通的大肠杆菌
胰岛
转基因大肠杆菌
（分泌胰岛素）
问：基因工程在实施这些精确的操作的时候又需要哪些工具呢？目的基因是如何提取，又是如何导入的呢？
胰岛素基因
大肠杆菌
（含胰岛素基因）
基因工程需要什么工具？如何进行？
1.基因工程定义：有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术。其核心是构建重组的DNA分子，又称重组DNA技术。
（1）.操作对象：基因
（2）.操作水平：分子水平。
一.基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来
基因重组
（3）.基本原理：
（4）.操作结果：
（不产生新基因，产生新物种吗？）
从此大肠杆菌的身上得到了世界上从没有过的基因？
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
被转移的基因仍然具有一定的独立性和完整性，其结构不变，只是位置改变
2.基因工程的诞生:
(5)1973年,科学家证明质粒可以作为基因工程的载体,构建重组DNA,使外源基因在原核细胞中成功表达,并实现物种间的基因交流。
（1）1944年,艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验证明了DNA是遗传物质，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
(2)1953年,沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。随后，克里克提出中心法则，阐明了遗传信息的传递和表达的机制。
(3)1961年,尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。
(4)20世纪70年代初,多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现,为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
基因工程诞生的理论基础包括：
（1）DNA是遗传物质的证明
（2）DNA双螺旋结构的发现和“中心法则”的确立、
（3）遗传信息的传递和表达的机制认定、
（4）遗传密码的破译。
不同种生物的DNA能拼接成功的原因：
所有生物的DNA具有相同的化学组成（脱氧核苷酸）和空间结构（双螺旋结构）。
各种生物共用一套遗传密码。
即同一个基因在不同生物体内内能够表达出相同的蛋白质的原因：
人的胰岛素基因在大肠杆菌细胞内，合成人的胰岛素。
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
培育能生产人胰岛素的转基因大肠杆菌
3.基因工程诞生的技术保障（工具）：
限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体的发现与应用。其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶为基因的分离和重组提供了必要的手段（工具酶），而载体能够将外源基因运送到细胞中。
思考：基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？
有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种内进行；基因工程可以在不同物种间进行，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
基因工程育种的优点
与杂交育种相比：
与诱变育种相比：
能定向地改造生物的遗传性状
克服远缘杂交不亲和障碍
1．限制性内切核酸酶（限制酶）
二、对DNA进行剪切、连接和复制，实现重组DNA技术的基础
基因工程重要工具的发现将体外重组DNA技术变为现实
2、DNA连接酶（T4噬菌体、大肠杆菌）
3．载体：具备自主复制能力的DNA分子。
（1）来源: 从微生物(主要是原核生物)体内分离出来
（2）作用:
1.限制性核酸内切酶——基因的“剪刀”
（3）切割部位：
磷酸二酯键 （消耗水）
切点
目的基因
5’
3’
5’
3’
注意：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
（专一性）
(4)存在于细菌等微生物中的作用：破坏外源DNA，自身DNA不会被破坏（自身DNA经过相应的化学修饰），起到保护作用，是其进化出的一种防御机制。（将外源DNA分子从内部剪切成片段，不是核苷酸）
(5)作用特点：识别双链DNA上特定的一小段核苷酸序列，并催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解，使得DNA双链在特定的位置断开。一般4~8个核苷酸对，6个核苷酸对最常见。
思考能否切割烟草花叶病毒上人们想要的目的基因？
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。所以，简单来说,限制酶在原核生物中起到的作用为：切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰
中轴线
在G与A之间切割
大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
（6）作用结果
　
黏性末端　　　　
黏性末端
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
（6）作用结果
思考一：用限制酶切割后的DNA分子，有几个黏性末端？这几个黏性末端有何特点？
两个，黏性末端相同且它们之间正好能够互补配对。
SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
中轴线
在G与C之间切割
（6）作用结果
平末端　　　平末端
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
（6）作用结果
练习1 画出以下限制酶作用后产生的黏性末端。
↓
BamHⅠ：5’-GGATCC-3’
↓
BglⅠ：5’-AGATCT-3’
↓
BstBⅠ：5’-TTCGAA-3’
5’-GGATCC-3’
3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’
3’-TCTAGA-5’
5’-TTCGAA-3’
3’-AAGCTT-3’
1.不同限制酶识别的核苷酸序列不同。
2.不同限制酶作用后可能会产生相同的黏性末端。——（同尾酶）
专一性--识别特定的序列、有特定的切点
5’-GGATCC-3’
3’-CCTAGG-5’
BamHⅠ
5’-TGATCA-3’
3’-ACTAGT-5’
BclⅠ
5’-AGATCT-3’
3’-TCTAGA-5’
BglⅡ
思考二：用不同种限制酶切割不同的DNA分子，黏性末端可能互补配对吗？
有可能
用限制性内切核酸酶剪切不同的DNA分子得到了不同来源的片段，具有互补配对的黏性末端或平末端。这正是能将不同来源的DNA片段连接起来的基础。
练习2：
限制性核酸内切酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC—
限制性核酸内切酶II的识别序列和切点是↓GATC—
下图表示含有某目的基因的DNA分子片段。
（1）若想将目的基因剪切下来，应选择何种限制性内切酶？
至少需要2个限制酶的切点,切断4个磷酸二酯键,产生4个黏性末端
酶II
（2）要想获得某个特定的基因，至少需要几个限制性酶切位点，切断几个磷酸二酯键？产生几个黏性末端？
CTTCATG
GAAGTACTTAA
GAATTCCGTAGAATTCGGATT
CTTAAGGCATCTTAAGCCTAA
练习3 用同一种限制酶来切割两种来源不同的DNA
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
AATTCCCTAA
GGGATT
CTTCATGAATTCCCTAA
GAAGTACTTAAGGGATT
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
甲DNA片段
乙DNA片段
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
磷酸二酯键
2.DNA连接酶—— 基因的“针线”
1、作用：通过作用形成磷酸二酯键，能将不同来源的DNA片段连接成一个重组DNA分子。
2、分类：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点
大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键，
只是一个是切开，一个是连接
氢键的断裂与形成与限制酶、DNA连接酶无关。
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点
大肠杆菌
T4噬菌体
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
T
A
T
A
EcoRI
EcoRI
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
用同一种限制酶来切割两种来源不同的DNA，
会产生相同的黏性末端。
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不同点 作用实质
作用结果
模板
相同点
催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键
催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子
催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
需要
不需要
①化学本质都是蛋白质②都是催化形成磷酸二酯键
DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
3、与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键
作用对象 DNA片段 DNA分子 单个的脱氧核苷酸 DNA分子
作用结果 将DNA片段连接成一个重组DNA分子 切割DNA 分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA
分子局部解旋为单链
思考：
用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要形成几个磷酸二酯键？
2个
用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？
4个
外源基因（如生长激素基因）怎样才能运送到受体细胞（如大肠杆菌细胞）？
需要“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体
载体：具备自主复制能力的DNA分子。
(1)作用：能与外源DNA相连接并将其送入受体细胞 进行扩增（外源DNA片段自身很难在受体细胞内成功复制，需要与含有复制起点的DNA分子相连 ）。
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（2）质粒(最常用的载体)
拟核DNA
质粒
大肠杆菌细胞
概念：能进行自我复制的环状DNA分子
位置：独立于细菌拟核DNA之外
（3）特点：
A.含有复制起点，能够独立自主复制并稳定存在
B.含有一种或多种限制酶的识别序列，方便外源基因插入载体中
C.具有筛选作用的标记（抗生素抗性基因），以便能够通过表型鉴别含有载体的细胞
D.对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
质粒是一种常用载体（天然质粒经人工改造）
①大多数质粒的受体细胞是细菌，质粒在细菌内可以独立自主复制。
②质粒具有多种限制酶识别序列，其携带的基因也会控制细菌的某些性状。（抗生素的合成基因、固氮基因）
小思考：要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？
【答案】要切2个切口，产生4个黏性
(平)末端。
质粒是一种常用载体（天然质粒经人工改造）
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因,而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上,能够生存的是被导入了载体的受体细胞(如下图所示)。
CTTCATG
GAAGTACTTAA
GAATTCCGTAGAATTCGGATT
CTTAAGGCATCTTAAGCCTAA
练习3 用同一种限制酶来切割两种来源不同的DNA
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
AATTCCCTAA
GGGATT
CTTCATGAATTCCCTAA
GAAGTACTTAAGGGATT
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
甲DNA片段
乙DNA片段
质粒中的限制酶切位点
目的基因
只有这一种可能吗？
CTTCATG
GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA
GGGATT
CTTCATG
GAAGTACTTAA
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
AATTCCCTAA
GGGATT
。。。。。。
注意的事项
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶, 目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生,可采取的措施是:
.
(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
两
4
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
（3）载体的种类
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
下图所示为大肠杆菌及质粒的结构
模式图,据图探究以下问题。
1.a代表的物质和质粒都能进行自我复制,它们的化学本质是什么
提示 a为拟核DNA,它和质粒的化学本质都是DNA 。
外源DNA进入受体细胞的载体
3.氨苄青霉素抗性基因能控制某物质的合成,该物质能抵抗氨苄青霉素,使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。因此,氨苄青霉素抗性基因在基因工程载体上能起什么作用
提示 用作标记基因,以便能够通过表型鉴别含有载体的细胞。
例题1.下图是四种不同质粒的结构示意图,其中ori为复制起点,ampr为氨苄青霉素抗性基因,tetr为四环素抗性基因,箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA分子的细胞,应选用的质粒是(　　)
C
例题2.在基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是 ,限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是 。根据下图判断,下列操作正确的是(　　)
A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C.质粒用限制酶Ⅱ切割,目的基因用
限制酶Ⅰ切割
D.质粒用限制酶Ⅰ切割,目的基因用
限制酶Ⅱ切割
D
（一）、活动原理
细胞核内的DNA与蛋白质结合成染色体，提取和DNA先要破坏细胞。
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
(1)幼嫩的植物材料如果经过冷冻后再研磨，细胞结构容易被破坏。
(2)用十二烷基硫酸钠 (SDS)处理材料，能使核蛋白变性并与DNA分离。
(3)乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解。
(4)DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度高，且Na＋与DNA形成钠盐。
(5)DNA钠盐不溶于酒精而某些蛋白质能溶于酒精，若在提取液中加入95%的冷酒精，能使DNA钠盐形成絮状沉淀物而析出。
(6)在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
三、活动:DNA的粗提取和鉴定
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
（二）、材料用具
1.选材：
注意：
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
（三）、方法步骤：
取材、研磨
过滤或离心取上清液
预冷酒精析出DNA
NaCl溶液溶解DNA并鉴定
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
1.取材、研磨：
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
研磨的目的：
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
2.过滤或离心取上清液：
在漏斗中垫上尼龙纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，3000r/min的转速下离心2min，再取上清液放入烧杯中。
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用：
3.预冷酒精析出DNA
在上清液中加入体积是上清液两倍的预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置3～5min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
搅拌时应轻缓、并沿一个方向原因：
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。向两支试管中各加入2mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于95℃水浴锅加热10min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
实验组
对照组
水浴加热
结果分析与评价
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。

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