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第2章 细胞工程
首个体细胞克隆动物
克隆动物多莉羊
体细胞克隆猴
“中中”和“华华”
如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖？
细胞工程
应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
原理和方法
操作水平
目的
分类
细胞生物学、分子生物学和发育生物学
细胞器、细胞或组织水平
获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品
植物细胞工程和动物细胞工程
哈伯兰特提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功。
斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体
古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。
1902年
1958年
1960年
1964年
1971年
1974年
【科技探索之路】植物细胞工程的发展历程
【从社会中来】
“其茅葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨（dài）夫花开，凝晴滚露，万态千妍，薰（xūn）风自来，四坐芬郁，岂非入兰室乎！岂非有国香乎！”这是我国历史上第一部兰谱——《金漳（zhānɡ）兰谱》（宋·赵时庚）中对兰花的一段描述。
从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢养兰花。但是，兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。
如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？
植物组织培养技术
第1节 植物细胞工程
01
植物组织培养技术
目录 /CONTENTS
一、植物细胞工程的基本技术
叶子
花瓣
花粉
细胞
植物体
01
植物组织培养技术
一、植物细胞工程的理论基础是什么
细胞的全能性

1.细胞全能性的定义：
细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。
2.细胞具有全能性的根本原因：
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全部遗传物质。
每一个体细胞都是由同一个受精卵细胞经有丝分裂增殖分化而形成的。
体细胞内的遗传物质（基因）与受精卵完全一样。
3.全能性大小的比较：
①体细胞全能性与细胞分化程度：
植物细胞>动物细胞
【说明】特例：卵细胞虽然已经高度分化，但仍具有较高的全能性。
②体细胞全能性与细胞分裂能力：
分裂能力强的＞分裂能力弱的
③不同类型细胞的全能性：
受精卵＞生殖细胞（配子、精子、卵细胞）＞体细胞
受精卵＞干细胞＞体细胞
④不同生物细胞的全能性：
一般来说，细胞分化程度越高，细胞全能性越低。
负相关
不体现全能性的实例：
芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶
4.生物的生长发育过程中，细胞并不是所有细胞都表现出全能性，而是分化成各种组织和器官。
①细胞分化：在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程，叫做细胞分化。
②细胞分化的实质：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因选择性表达。
③全能性表现的条件：具有完整的细胞结构，处于 状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。
离体
④体现细胞全能性的标志：细胞→ 完整 或其他 。
生物体
各种细胞
【强调】细胞分化时遗传物质保持不变。
二、植物组织培养技术
1.概念：
指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
2.原理：
植物细胞的全能性
外植体？
离体培养的植物器官、组织或细胞被称为外植体。
3.繁殖方式：
无性繁殖
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
4.一般过程：
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽等
试管苗
驯化移栽
完整植株
相关概念
①脱分化：
在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞失去其特有的结构和功能，转变为未分化的细胞，进而形成愈伤组织的过程。
②愈伤组织：
脱分化形成的不定形的薄壁组织团块。
③再分化：
愈伤组织重新分化成芽、根等器官的过程。
（1）离体状态； （2）无菌操作
（3）种类齐全、比例适合的营养物质
（4）植物激素（主要是生长素和细胞分裂素）诱导和调节
（5）适宜的外界条件（温度、pH、光照等）
④适宜的
培养条件
细胞特点？
细胞排列疏松无规则、高度液泡化、色浅，具有较强的分裂能力
三、【探究 实践】菊花的组织培养
1.实验原理：
①植物细胞一般具有全能性。
②在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织接种到含特定激素的培养基上，就可以诱导其再分化成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株。
③植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。
2.材料用具
①外植体：
幼嫩的菊花茎段
（容易诱导形成愈伤组织）
②体积分数为70%的酒精：
对手、超净工作台、外植体进行消毒
③质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液：
对外植体进行消毒
④无菌水：
清洗外植体
⑤培养基（P116--参见本书附录1）
包括无机营养成分（水和无机盐）、有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）。
蔗糖的作用：
提供营养
灭菌方法为：
湿热灭菌法
维持培养基的渗透压
固体培养基
1）培养基名称： ；
2）物理性质： ；
3）碳源： 。
植物组织培养常用的培养基配方
P116
3.方法步骤
（1）消毒
①双手和超净工作台台面：
用酒精擦拭
②外植体:
流水冲洗
→酒精消毒30s
→无菌水清洗2～3次
→次氯酸钠溶液处理30min
→无菌水清洗2～3次。
（2）外植体切段
将消过毒的外植体置于无菌培养皿中
→用无菌滤纸吸去表面的水分
→用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。
（3）接种外植体
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。
用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
【注意】接种时注意外植体的方向，不要倒插！
将“形态学上端”朝上，下端朝下
（4）脱分化——诱导愈伤组织
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
【注意】该过程一般不需要光照
培养基及培养条件：
激素比例1：1
有光易形成维管组织，不易形成愈伤组织。
提供有机碳源（蔗糖）
细胞排列疏松无规则、高度液泡化
异养生活
（5）再分化——诱导生芽生根
培养15～20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上培养。
长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
【注意1】诱导顺序：先诱导生芽，再诱导生根！
【注意2】该过程每日需要给予适当时间和强度的光照！
（6）移栽培养
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。
用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。
每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
菊花的组织培养【探究·实践】
总结：植物组织培养的基本流程
①外植体消毒
②外植体切段
③接种外植体
④诱导愈伤组织
⑤诱导生芽生根
⑥移栽
4.实验结果分析与评价
（1）接种3～4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，有多少能正常生长，试分析它们被污染的原因。
培养基、接种工具灭菌不彻底；
外植体消毒不彻底；
操作过程不符合无菌操作要求等。
（2）从刚接种的外植体到长出愈伤组织需经历多少天？
一般需要2周左右
（3）你培育的幼苗移栽到露地后，能够正常生长吗？
生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。
培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷酒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12h。掀开塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。可以在课后统计移栽的成活率，看看移栽是否合格。
（4）植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。
生长素/细胞分裂素 结果
比值高(＞1)
比值低(＜1)
比值适中(=1)
有利于根的分化，抑制芽的形成
有利于芽的分化，抑制根的形成
促进愈伤组织的形成
生长素类作用：用于诱导细胞的伸长生长和根的分化；
细胞分裂素类作用：促进组织细胞的分裂或从愈伤组织和器官上分化出不定芽。
5.进一步探究
若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？
① 空白对照：不加任何激素；
② 实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1；
③ 实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1；
④ 实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。
生长素/细胞分裂素 结果
比值高(＞1)
比值低(＜1)
比值适中(=1)
有利于根的分化，抑制芽的形成
有利于芽的分化，抑制根的形成
促进愈伤组织的形成
②接种时注意外植体的方向，不要 。
③脱分化诱导愈伤组织期间一般 光照，在后续的培养过程中，每日 给予适当时间和强度的光照。
【总结：植物组织培养过程需要注意的问题】
①实验中使用的培养基和所有的器械都要 。接种操作必须在酒精灯 进行，并且每次使用后的器械都要 。
火焰旁
灭菌
灭菌
为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？
避免杂菌与培养物竞争营养，且有些杂菌会危害培养物的生长。
倒插
不需要
需要
若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性。
【总结】植物组织培养中细胞表现出全能性的条件
（1）离体（最关键）:
（2）严格的无菌条件：
①对操作环境、双手、外植体进行消毒；②对培养基和器械进行灭菌；③接种操作必须在酒精灯火焰旁进行。
（3）适宜的培养条件：
（4）适宜浓度和比例的激素：
（5）一定的营养条件：
温度，光照
包括有机营养成分、无机营养成分
主要是生长素和细胞分裂素
（1）植物体的任何细胞都具有全能性，也都能表现出全能性 （　 　）
（2）脱分化和再分化是植物组织培养的重要过程 （ 　　）
（3）在植物组织培养时，对外植体要进行灭菌处理 （　 　）
（4）诱导生芽的培养基和诱导生根的培养基完全一样 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
第1节 植物细胞工程
01
植物组织培养技术
目录 /CONTENTS
一、植物细胞工程的基本技术
欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你会有什么办法呢？
利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？
番茄—结马铃薯
不能
不同种生物之间存在着生殖隔离
1.植物体细胞杂交的过程
A细胞
B细胞
纤维素酶果胶酶
①去壁：
酶解法
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
②诱融
物理法
化学法
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法、
高Ca2+ —高pH融合法等
脱分化
再分化
移栽
植物细胞融合
植物组织培养
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
移栽后的植株
杂种细胞
过程分析
细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合）
酶解法
纤维素酶和果胶酶
植物细胞的细胞壁主要由纤维素和果胶构成
（1）去除细胞壁
①去壁原因：
②方法：
③相关酶：
④纤维素酶和果胶酶的酶溶液中一般加入一定浓度的无机盐离子和甘露醇，试分析原因？
使溶液具有一定的渗透压，防止原生质体吸水过多而涨破，保持原生质体正常。
等渗溶液
原生质体
原生质层
原生质体
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡
细胞核
原生质层
成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质
（2）两个标志
①植物细胞融合完成的标志：
再生出新的细胞壁，形成杂种细胞
②植物体细胞杂交完成的标志：
培育成新的植物体
参与此过程中的主要细胞器是？
验证再生出新壁的实验？
质壁分离和质壁分离复原实验
高尔基体
（3）融合细胞类型的分析
①A种原生质体与B种原生质体融合后，有哪几种类型（只考虑两两融合）？而我们需要的是哪种类型？所以原生质体融合后，我们要进行怎样的处理？
有 种融合类型：
AA、BB、AB
我们需要的是？
AB
3
培养基中共有 种类型的细胞？
因此要对融合后的原生质体进行 。
筛选
AA、BB、AB
A、B
5
【问题探究4】若植物A的基因型是AaBb，植物B的基因型是aaBb，则只考虑细胞之间的两两融合，则融合形成的细胞基因型有 种，分别是
AAaaBBbb
aaaaBBbb
AaaaBBbb
√
3
杂种细胞
②若A细胞具有2x条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb。B细胞含有2y条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd，则通过植物体细胞杂交技术获得的新植株
染色体条数？
染色体组数？
基因型？
属于可遗传变异类型中的？
2x＋2y
4个
AabbccDd
染色体数目变异
两亲本染色体数之和
两亲本染色体组数之和
两亲本基因型之和
异源多倍体
【问题探究5】总结：有性杂交与植物体细胞杂交的比较
植物A体细胞染色体数20条 植物B体细胞染色体数40条 有性杂交 后代体细胞中染色体数 条
植物体细胞杂交 后代体细胞中染色体数 条
植物A为二倍体植物B为四倍体 有性杂交 后代为 倍体
植物体细胞杂交 后代为 倍体
有性杂交遵循孟德尔遗传规律
植物体细胞杂交不遵循孟德尔遗传规律
30
60
三
六
2.植物体细胞杂交的概念：
植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
原理（理论基础）？
植物细胞融合
植物组织培养
细胞膜的流动性
植物细胞的全能性
白菜
甘蓝
白菜－甘蓝
具有两个物种的遗传物质
3.植物体细胞杂交的实例：
具有生长期短、耐热性强和易于贮藏等优点
多种柑橘属不同种间的杂种植株
普通小麦—长穗偃麦草
4.植物体细胞杂交的意义：
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育了植物新品种。
5.植物体细胞杂交存在的问题：
有些杂种植株还未按照人们的意愿表现出亲代的优良性状。
如，番茄—马铃薯
"番茄—马铃薯"杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么
生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以"番茄—马铃薯"杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂种植株自然就不能地上结番茄、地下长马铃薯了。
（1）植物体细胞杂交技术的目的是获得杂种细胞 （　 　）
（2）植物体细胞杂交利用了植物组织培养技术 （ 　　）
（3）植物原生质体融合的原理是植物细胞的全能性 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
【网络构建】
练习与应用
一、概念检测
1.下图是利用甲、乙两种植物的各自优势，通过植物细胞工程技术培育高产、耐盐的杂种植株的实验流程图。下列相关叙述错误的是 （ ）
A.进行a处理时能用胰蛋白酶
B.b是诱导融合后得到的杂种细胞
C.c是培养后得到的具有耐盐性状
的幼芽
D.进行d选择时要将植株种在高盐
环境中
A
2．实验人员制备了矮牵牛（2n＝14）红色花瓣（液泡呈红色）与枸杞（4n＝48）叶肉细胞的原生质体，并诱导其融合，经筛选、培养获得杂种植株。下列说法错误的是 （　 　）
A．生成杂种细胞标志着植物体细胞杂交成功
B．可以突破自然生殖隔离的限制而得到种间杂种植株
C．若原生质体均为两两融合，则融合后的细胞中染色体数目可能
为62条或28条或96条
D．参与杂种细胞的细胞壁形成的细胞器主要是线粒体和高尔基体
A
3．如图是甲、乙两种植物体细胞杂交的过程，下列有关分析不正确的是 （　　 ）
A．过程①表示用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁
B．过程②的原理为细胞膜的选择透过性
C．过程③是杂种细胞再生出细胞壁的过程
D．过程④和⑤分别表示脱分化、再分化过程
B

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