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发酵工程是指利用微生物的特定功能,通过现代工程技术,规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。
第1章 发酵工程
【从社会中来】
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。
由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致胃肠不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。
那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
首先酸奶制作所用的容器要进行消毒晾干后使用，避免酸奶制作过程中混入杂菌；其次，准备好菌种，最好是纯的乳酸菌菌种；再有就是接种时要在无菌条件下操作，所用搅拌器要经过消毒灭菌等。
需要应用无菌技术 和 微生物的培养技术。
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
实验室培养微生物的要求？
①要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；
②要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
第2节 微生物的培养技术及应用
01
培养基的配制
目录 /CONTENTS
一. 微生物的基本培养技术
【相关信息】什么是微生物？哪些生物属于微生物吗？
微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称。
特点：结构相当简单，形体微小，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能观察到。
微生物的类群
原核生物（细菌、蓝细菌等）
原生生物（如草履虫、衣藻等）
真菌 （如酵母菌、霉菌等）
病毒（无细胞结构）
真核生物
01
培养基的配制
1.培养基概念：
3.培养基常见类型：
2.培养基作用：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
固体
培养基
液体
培养基
如，琼脂
分离、
计数、
鉴定等
扩大培养
工业生产
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
有、无添加凝固剂
琼脂是一种从红藻中提取的多糖
琼脂在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。
固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。
拓展：培养基的类型
划分 培养基种类 特点 用途
物理 性质
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、分类鉴定。
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
容器放倒不致流出，剧烈震动则破散
固体培养基：菌落
单个微生物在琼脂固体培养基上大量繁殖时，就会在培养基表面或内部形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
一个菌落就是一个种群
菌落是鉴定菌种的重要依据
划分 培养基种类 特点 用途
化学 成分来源
用途 功能
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂，用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
拓展：培养基的类型
用已知成分的化学物质配制
【注意】病毒为非细胞结构生物，只能在活细胞中营寄生生活，目前不能利用人工培养基来培养。
4.培养基的营养构成：
各种培养基的配方不同，但一般都含有水、 无机盐、碳源和氮源等营养物质。
①概念：
（1）碳源
②种类：
凡是能提供碳元素的物质，统称为碳源
无机碳源
有机碳源
CO2、CO32-、HCO3-等含碳无机物
糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等含碳有机物，常用：糖类，尤其是葡萄糖。
③功能：
主要用于构成细胞物质和一些代谢产物；
有机碳既是碳源又是异养微生物的能源物质。
自养微生物
异养微生物
【说明】含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。
①概念：
（2）氮源
②种类：
③功能：
凡是能提供氮元素的物质，统称为氮源
无机氮源
有机氮源
主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等
NH4＋、NO3-、NH3等
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
（3）水
（4）无机盐
①良好的溶剂；
②维持生物大分子结构的稳定。
①提供无机营养；
②调节pH；
③维持渗透压。
培养基组分及含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
H2O 定容至1000ml
【例】某种常见的细菌培养基——1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
碳源、磷酸盐和维生素等
氮源和维生素等
无机盐
水
又称肉汤培养基，用于培养细菌
（5）培养基还需满足微生物对pH、特殊营养物质以及O2的需求
④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ；
②培养霉菌时，需要将培养基调至 ；
③培养细菌时，需要将培养基调至 ；
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
【补充】生长因子：微生物生长必不可少、需求量很少的物质；某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。
目的要明确；营养要协调；pH要 适宜。
培养基的配制原则
【例】几种微生物的营养和能量来源分析
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 NH4＋、NO3-等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
大肠杆菌 糖类、蛋白质 等有机物 蛋白质等 有机物
用无碳培养基可以筛选培养什么微生物？
用无氮培养基可以筛选培养什么微生物？
自养微生物
固氮微生物
（1）用于发酵的微生物主要指细菌和真菌 （　 　）
（2）培养基中加入琼脂的目的是提供碳源 （　 　）
（3）所有微生物在培养时，培养基中都需加入氮源 （　 　）
（4）培养不同微生物的培养基成分完全一样 （ 　　）
判断常考语句，澄清易混易错
01
培养基的配制
目录 /CONTENTS
一. 微生物的基本培养技术
获得纯净的微生物培养物的关键是 ，
主要包括 和 。
防止杂菌污染
消毒
灭菌
无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
还能有效避免操作者被微生物感染。
1.消毒：
指使用较为 的物理、化学或生物等方法杀死物体 或内部 微生物。
温和
表面
一部分
消毒方法 主要方法 应用范围
煮沸 消毒法 家庭餐具等生活用品
巴氏 消毒法 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不耐高温的液体
（2）消毒的主要方法及应用范围
100 ℃煮沸5～6 min
62～65 ℃ 消毒30 min
或80～90 ℃处理30 s～1 min
（1）概念：
消毒方法 主要方法 应用范围
紫外线 消毒 接种室、接种箱
或超净工作台
消毒方法 主要方法 应用范围
化学 药剂 消毒 皮肤、伤口、动植物组织表面消毒、空气、手术器械、塑料或玻璃器皿
30 W紫外灯照射30 min
（损伤细菌的DNA）
以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，先适量喷洒石炭酸（苯酚）或煤酚皂溶液等消毒溶液以加强消毒效果。
用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒
用氯气消毒水源
生物消毒法
指利用微生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。
例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
消毒的方法：
①煮沸消毒法： 100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒法： 62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min。
③化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。
④紫外线消毒法：用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。
2.灭菌：
（1）概念：
指使用 的理化方法杀死物体内外 的微生物，包括芽孢和孢子。
强烈
所有
芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
（3）灭菌的主要方法及应用范围
①灼烧灭菌
②干热灭菌
③湿热灭菌
高压蒸汽灭菌锅
干热灭菌箱
①灼烧灭菌
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
效果：
原理：
对象：
最彻底
使微生物燃烧
接种工具如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，
接种过程中的试管口或瓶口等容易被污染的部位
干热灭菌箱内，在160-170 ℃的热空气中维持下2-3h达到灭菌目的
②干热灭菌
原理：
使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
对象：
耐高温，需保持干燥的物品
玻璃器皿 （如试管、培养皿、吸管、注射器）
金属器具 （如针头、 镊子、剪刀等）
③湿热灭菌
实验室常用高压蒸汽灭菌锅，在压力100kPa、温度121 ℃条件下，维持15-30min
利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌
原理：
对象：
优点：
高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
培养基等
使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
【强调】
3.比较消毒和灭菌
项目 消毒 灭菌
作用强度 较为 ； 的物理、化学因素
消灭微生物的数量 物体表面或内 部 微生物 物体内外的 微生物
能否消灭 芽孢、孢子 消灭部分芽孢 能消灭全部芽孢和孢子
适用对象 操作空间、操作者的衣着 和手等 接种环、接种针、玻璃器皿、
培养基等
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌
温和
强烈
一部分
所有
一下物品所采用的灭菌或消毒方法依次是
培养基
培养皿
接种环
实验操作者的双手
实验室
牛奶
湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
干热灭菌
灼烧灭菌
化学药剂消毒（酒精）
紫外线消毒
巴氏消毒法
4.无菌技术的具体内容
（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和 。
（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行 。
（3）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 接触。
（4）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 并在 附近进行。
消毒
灭菌
周围的物品
酒精灯火焰
超净工作台上
（1）获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染 （　 　）
（2）灭菌相比消毒对微生物的杀灭更彻底 （　　 ）
（3）无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料（如培养基、接种环等）都可采用干热灭菌法进行灭菌 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
01
培养基的配制
目录 /CONTENTS
一. 微生物的基本培养技术
一、微生物的纯培养
1.纯培养的概念
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
获得纯培养物的过程就是纯培养。
2.纯培养的步骤
（1）配制培养基
（2）灭菌（培养基和器具）
（3）微生物接种
（4）分离
（5）恒温箱中培养
二、【探究--实践】酵母菌的纯培养
1.实验原理：
微生物群分散或稀释成单个细胞，单个细胞繁殖成单个菌落。
①菌落
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。
②纯培养的方法：
一个菌落就是一个种群
2.实验方法步骤
第一步：制备培养基
①配制培养基 → ②灭菌 → ③倒平板
①配制培养基
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
马铃薯琼脂培养基
②灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa 、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。
将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃ 灭菌2h。
③倒平板
待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，冷凝后培养皿倒置。
灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。
【问题分析与归纳总结】配制培养基的注意事项
如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成后，灭菌之前进行操作。
①培养基pH要适宜
（灭菌前/灭菌后)调pH
②培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。其原因是？
琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不及时操作，琼脂会凝固。
用手触摸锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
你用什么办法来估计培养基的温度？
③倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
④在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
⑤平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固的培养基表面湿度也比较高。
将平板倒置，既可以防止水分过快蒸发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
⑥怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
【例】倒平板是制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的重要环节，如图为倒平板的操作示意图。
（1）请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程： 。
（2）甲、乙、丙中的灭菌方法是 。
（3）丁中的操作需要等待 才能进行。
丙→乙→甲→丁
灼烧灭菌
平板冷却凝固
第二步：接种和分离酵母菌
1.方法：平板划线法
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
2.平板划线法的操作步骤：
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
②在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞
③将试管口通过火焰
④将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次划线相连。
第1次划线
灼烧接种环灭菌
第2次划线
灼烧接种环灭菌
第3次划线
灼烧接种环灭菌
灼烧接种环灭菌
1
2
3
4
5
【平板划线法注意事项】
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；
②划线首尾不能相接；
③每次划线前灼烧接种环进行灭菌；
④划线操作结束后，仍需灼烧接种环，培养皿倒置培养。
分区划线法
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
【问题探究1】为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上原有微生物
接种环共需灼烧几次？
6次
【问题探究2】在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是？
划线后，线条末端酵母菌的数目比线条起始处要 ，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步 ，最终能得到由 细胞繁殖而来的 。
【问题探究3】为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？
最后一次划线已经将细菌稀释成 的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，达不到纯化的效果。
少
减少
单个
菌落
单个
【归纳总结】平板划线法接种菌种时，可防止杂菌污染的操作
①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
②划线操作在酒精灯火焰旁进行。
③接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。
④划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
第三步：培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 28℃ 左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养 24 ~ 48h。
警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
用记号笔标记培养皿中菌落
应标记在？
皿底上
平板划线法可以对菌种进行分离，能否对培养液中菌种进行计数呢？
不能计数
【问题探究1】设置未接种平板组的意义是什么？
通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被 或
是否彻底。
污染
灭菌
【问题探究2】下列接种过程正确的顺序是？
b a e f c g d
3.实验结果分析
①培养未接种的培养基的目的是检测培养基是否被杂菌污染（或检查培养基制备是否合格）。未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被 ，应该重新制备；若无菌落生长，则说明未被污染。
②在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
③若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中 。
污染
被杂菌污染
（1）倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置 （　 　）
（2）倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到
皿盖上 （　 　）
（3）若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用 （ 　　）
（4）为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 （ 　 ）
（5）平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧 （　 　）
（6）培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
评估论点的可信程度
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
“酵素”是什么？水果“酵素”的制作原理是什么？水果“酵素”中可能含有哪些成分？它是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？水果“酵素”中的所有成分都有益于人体健康吗？
如果要更加有力地支持或反驳水果“酵素”有益健康的论点，应该怎样获取证据？
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
评估论点的可信程度
【网络构建】
练习与应用
一、概念检测
1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。 （ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。 （ ）
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
二、拓展应用
提示：意味着培养液中O2含量不同。
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
二、拓展应用
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
提示：培养液中O2含量越高，酵母菌种群密度越大。
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
二、拓展应用
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
提示：这时候已经达到了环境容纳量。

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