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发酵工程是指利用微生物的特定功能,通过现代工程技术,规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。
第1章 发酵工程
【从社会中来】
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
该怎么办呢？
选择培养基解决了这一难题！
第2节 微生物的培养技术及应用
01
选择培养基
目录 /CONTENTS
二. 微生物的选择培养和计数
01
选择培养基
1. 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
耐高温的酶？
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
美国黄石公园
2.实验室微生物筛选的原理
启示？
寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，
即人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
3.选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
4.选择培养基举例
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80℃的高温
添加某种化学物质 加入青霉素
高浓度食盐
特殊碳、氮源 石油是唯一碳源
营养缺陷 不加碳源
不加氮源
水生栖热菌
酵母菌、霉菌等真菌
金黄色葡萄球菌
能消除石油污染的微生物
自养型微生物
固氮菌
【思考·讨论】选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
讨论1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
培养基二
讨论2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
①从物理性质来讲，两者属于 培养基；
②从用途上来讲，培养基二属于 培养基，
目的是为了获得 ；
③两种培养基共有的培养基成分
有： ；
培养基一的碳源主要为 ，
氮源主要为 ；
培养基二的碳源主要为 ，
氮源为 。
固体
选择
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
【问题探究1】尿素是一种重要的农业氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的某些细菌将尿素分解成NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。细菌利用尿素的原理：土壤中分解尿素的细菌合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
①如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基，用尿素作为 ，可以将分解尿素的细菌分离出来。
②为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？
分解尿素的微生物能合成 ，可将尿素分解成 ，从而为微生物提供 。
唯一氮源
脲酶
NH3
氮源
③设计对照实验：如何验证所用的选择培养基没有受到污染？
将 的选择培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。
④该培养基与普通培养基有哪些相同点和不同点？
选择培养基与普通培养基相比，区别只是 ，培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
未接种
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
普通培养基
选择培养基
选择培养基以尿素为唯一氮源
01
选择培养基
目录 /CONTENTS
二. 微生物的选择培养和计数
【问题】1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得能分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
稀释涂布平板法
1.原理：
通过对土样进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上，即可得到能分解尿素的细菌的纯培养物。
2.方法：稀释涂布平板法
将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个细菌的菌落。
涂布平板
系列梯度稀释
3.稀释涂布平板法的操作流程
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
稀释10倍菌液
101
土样10g
①铲取土样，将样品装入纸袋中
注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。
②在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，充分摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
移液枪
微量 移液器
移液管
③取0.1ml菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液涂布均匀。
过多会导致菌液在培养基表面形成积液，导致菌体堆积，影响分离效果。
4.菌种培养和观察
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养
在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
01
选择培养基
目录 /CONTENTS
二. 微生物的选择培养和计数
一、计数方法1：稀释涂布平板法
1.计数原理
稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。
当样品的稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约含有多少活菌。
——间接计数法
2.计数原则
①一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
②样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。
在同一稀释度下，应至少对 个平板进行重复计数，然后求出 。
3
平均值
重复实验，减少误差
3.计数结果分析
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ；
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是 菌落。
②统计结果一般用 而不是用活菌数来表示。
少
菌落数
一个
4.计算公式
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M：代表稀释倍数
每克样品中的菌株数＝
×稀释倍数
【例】甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105
=9 ×107个
【问题探究2】请计算：4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为？个
1.1×108
5.稀释涂布平板法操作注意问题
①稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。
②涂布器浸在体积分数为70%的酒精中，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧。
③不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
二、计数方法2：显微镜直接计数法
——直接计数法
1.方法：
一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
血细胞计数板常用于 等的计数；
相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子
细菌计数板可对 进行观察和计数。
细菌等较小的细胞
2.优点：
快速直观
3.缺点：
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
三、稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的比较
项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、 等 培养基等
计数依据 菌株本身 培养基上的 数
优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌
缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差
血细胞计数板
细菌计数板
菌落
平板划线法
稀释涂布平板法
四、两种纯化方法的比较
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基 表面连续划线 系列梯度稀释操作
和涂布平板操作
接种工具
能否用 于计数 计数 计数，但是操作
复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征。 不能
可以
接种环
涂布器
（1）选择培养基只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物的生长 （ ）
（2）以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基 （ 　　）
（3）脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源 （ 　　）
判断常考语句，澄清易混易错
【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.提出问题（实验目的）
（1）如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）如何统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成 的微生物才能分解尿素，利用 的 培养基，可以从土壤中分离出 的细菌。
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
3.操作步骤
（1）土壤取样
①取样地点要求：
酸碱度接近中性的潮湿土壤，细菌适宜在该环境中生长。
②取样过程：
铲去表层土（一般铲去3cm左右）；细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（2）制备培养基
①以尿素为唯一氮源选择培养基做实验组，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
②以牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
（3）样品的稀释与涂布平板
在酒精灯火焰旁称取10g土壤，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，振荡使土壤与水充分混合，将细菌分散，制成101倍土壤稀释液。
用1支1mL无菌移液管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍的土壤稀释液。依次类推，制成103、104 、 105、106 、107倍的土壤稀释液。
①样品的稀释
②涂布平板
测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
每个浓度至少设置涂布4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。
如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
每个倍数稀释液设置涂布几个平板
【操作提示】
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。
例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
（4）培养与观察
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
②观察并记录：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
（5）菌落计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在 的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出 ，并根据所对应的稀释度计算出样品中 ；设计表格记录并计数。
30～300
平均值
菌落数
4.实验结果分析
现象 分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
（1）无菌操作
①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在火焰旁进行。
【操作提示】
（2）做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
（3）制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
【总结归纳】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需注意的问题
（1）为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
（2）恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
（3）为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组，目的是排除实验中偶然因素对实验结果的影响。
（4）分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
（5）为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
（6）统计的菌落数目往往比活菌实际数目低。
【问题探究3】甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
（1）甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果 （填“可靠”或“不可靠”），若不可靠，应如何改进？
为增加实验的说服力与准确性，应设置 实验，在同一稀释度下至少涂布 个平板，统计结果后计算 。
（2）乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理 （填“合理”或“不合理”）。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
不可靠
重复
3
平均值
不合理
【问题探究4】尝试完成下表中对微生物的分离与计数实验结果的分析。
目的 现象 结论
是否有杂 菌污染的 判断 对照的培养基中 菌落生长 未被杂菌污染
培养物中菌落数偏高 被杂菌污染
培养物中菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中 。
选择培养 基是否起 选择作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目 大于选择培养基上的数目 选择培养基
具有 作用
无
混入其他杂菌
选择
【问题探究5】利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？
不一定
因为有些微生物可以利用尿素分解菌的代谢产物进行生长繁殖。
（1）稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数 （　 　）
（2）测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同 （　 　）
（3）菌落特征是鉴别菌种的重要依据 （　 　）
（4）利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
【进一步探究】——分解尿素细菌的进一步鉴定
①原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
呈碱性
遇酚红指示剂呈 红 色
②方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。
可以观察菌落周围是否出现红色环带。
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况；
固体培养基：
——鉴别培养基
红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
【网络构建】
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。 （ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。 （ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。 （ ）
练习与应用
一、概念检测
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是 （ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。
几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈
（1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌，请你给出详细的实验方案。
用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。
几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
富含纤维素的环境
如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等
（3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
透明圈直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。

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