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第2章 细胞工程
首个体细胞克隆动物
克隆动物多莉羊
体细胞克隆猴
“中中”和“华华”
如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖？
【重温】植物体细胞杂交的过程
A细胞
B细胞
纤维素酶果胶酶
①去壁：
酶解法
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
②诱融
物理法
化学法
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法、
高Ca2+ —高pH融合法等
脱分化
再分化
移栽
植物细胞融合
植物组织培养
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
移栽后的植株
杂种细胞
那么，有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？
物体细胞杂交技术的优势：
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育了植物新品种。
第2节 动物细胞工程
01
动物细胞融合技术
目录 /CONTENTS
二、动物细胞融合技术与单克隆抗体
01
动物细胞融合技术
1.概念：
2.诱导原理和结果：
原理？
结果？
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
细胞膜具有一定的流动性
融合形成杂交细胞
具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
3.诱导融合的常用方法：
与植物原生质体融合的方法相同
物理方法：
电融合法、离心法
化学方法：
聚乙二醇（PEG）融合法
生物方法：
灭活病毒诱导法
动物细胞融合特有
【问题探究1】灭活病毒诱导细胞融合的原理
（1）灭活？
（2）灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
失去感染性保留抗原性
动物细胞融合完成的标志？
细胞核的融合
【问题探究2】19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中，观察到多核细胞。如何解释这一现象？
肺结核病人病理切片
病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
4.意义：
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
5.应用：
（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
至今，种间、属间、科间，甚至动植物之间融合都已获得了成功。
生物种类 细胞来源 成功年代
酵母菌—鸡 原生质体—血红细胞 1975年
人—胡萝卜 腹水癌细胞—原生质体 1976年
人—小鼠 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞 1978年
6.动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较
比较 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
步骤 酶解法去掉 后，诱导 融合，形成 ，再经植物组织培养形成 。 分散成 后诱导细胞融合，形成 。
方法 聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2＋—高pH融合法、电融合法、离心法 PEG融合法、电融合法、
诱导法
结果 形成？ 形成 ，以生产细胞产品
意义 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种 突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
细胞膜的流动性
细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞壁
原生质体
杂种细胞
杂种植株
单个细胞
杂交细胞
灭活病毒
杂种植株
杂交细胞
（1）与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒 （　 　）
（2）灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构 （　　 ）
（3）二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
01
动物细胞融合技术
目录 /CONTENTS
二、动物细胞融合技术与单克隆抗体
1.传统抗体的获得方法
（1）分泌细胞 化学本质
分布？
浆细胞
蛋白质
主要分布在血清中，少量分布于组织液和外分泌液中
（2） 获取方法：
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
（3）缺点：
产量低、纯度低、特异性差。
血清抗体
如何解决？
2．单克隆抗体的制备思路
（1）B淋巴细胞特点：
①哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的B淋巴细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。
实质是浆细胞
②动物体内产生的特异性抗体种类超过百万种，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
③要想获得大量单一抗体，必须克隆（大量增殖）单一的B淋巴细胞，形成细胞群。
④面临困难：在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。
如何解决这一难题？
（2）骨髓瘤细胞特点：
在体外培养条件下，能大量增殖。
英国：米尔斯坦
德国：科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
大胆设想
一种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
（能产生抗体）
（能大量增殖）
融合细胞
（既能产生抗体，又能大量增殖）
（3）杂交瘤细胞特点：
B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。
单克隆抗体：由单个B淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成基因型相同的细胞群，由这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
3．单克隆抗体的制备过程
注射特定的抗原进行免疫
培养骨髓瘤细胞
从脾中提取
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
能产生抗体，但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
【问题探究3】过程分析
①不注射抗原，直接提取B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，能得到单克隆抗体吗？给小鼠注射特定抗原的目的是什么？
②诱导细胞融合的方法有？
能从该小鼠的脾中得到可以产生特定抗体的B淋巴细胞。
不能
实质是浆细胞
物理方法：
电融合法
化学方法：
聚乙二醇（PEG）融合法
特有生物方法：
灭活病毒诱导法
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
多种杂交细胞
③若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？
B-B细胞
B-瘤细胞
瘤-瘤细胞
3种
杂交瘤细胞
【延伸】若只考虑细胞的两两融合，培养液中共会出现几种细胞？
5种
融合的细胞3种
未融合的细胞2种
诱导融合
多种杂交细胞
第一次筛选
用特定的选择培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
⑤资料分析：a.细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。
b.免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但它不能分裂增殖，其本身
也不能在体外长期存活。c.鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但它能不
断分裂增殖。如果它的D途径被阻断的话，它会因不能合成DNA而死。
请根据上述资料提出筛选出杂交瘤细胞的方法？
培养基中加入氨基蝶呤。
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖
又能产生抗体
第二次筛选
克隆化培养、抗体检测
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能与特定抗原结合）
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
经多次筛选
克隆化培养、抗体检测？
多孔细胞培养板
96孔板
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
①将杂交瘤细胞进行有限稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。
②然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
③阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
检测原理？
抗原—抗体杂交技术
多孔细胞培养板
阳性克隆的筛选和克隆化培养
用培养液有限稀释
克隆化培养
抗体检测
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
从细胞培养液中提取
从小鼠腹水中提取
体内培养
⑧★杂交瘤细胞的特点？
既能无限增殖，又能分泌特异性抗体
具备两种细胞的遗传物质
特异性强，灵敏度高，可大量制备
4.单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选 原因 诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选 目的 筛选出？ 筛选出 的杂交瘤细胞
筛选 方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞
能分泌所需抗体
死亡
抗体检测
生长
应用到的技术？
原理？
细胞膜的流动性
多种杂交细胞及未融合的细胞
诱导 融合
小鼠骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
给小鼠注射特定抗原
提取
杂交瘤细胞
第一次筛选
用特定的选择性培养基
第二次筛选
足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔
大量单克隆抗体
克隆化培养、抗体检测
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（能产生抗体）
（能无限增殖）
从腹腔液中提取
从培养液中提取
（进行多次）
动物细胞融合
动物细胞培养
细胞增殖
单克隆抗体制备过程
单克隆抗体制备过程
【思考 讨论】单克隆抗体的应用
【资料1】用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体
单克隆抗体被广泛用作诊断试剂
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
【资料2】使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates, ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
讨论1. ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
“生物导弹”
讨论2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
讨论3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；
生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
5．★单克隆抗体的优点
（1）能准确地识别抗原的细微差异；
（2）与特定抗原发生特异性结合；
（3）可以大量制备。
6．单克隆抗体的应用
（1）广泛用作诊断试剂
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
（2）运载药物：
如抗体-药物偶联物（ADC）。
生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤
(单抗导向，药物为弹头)
优点：位置准确、疗效高、副作用小
（3）直接用于治疗疾病。
实例：利妥昔单抗(美罗华)是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。
在医学领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。
（1）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞（　 　）
（2）单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同（ 　　）
（3）ADC的抗体具靶向运输作用、药物具有治疗作用（　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
【网络构建】
练习与应用
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
C
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为
杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离
出的抗体为单克隆抗体
A
3．如图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述正确的是 （ ）
A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的细胞毒性T细胞
B．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C．③同时具有脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞的特性
D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞
D
4．抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列表述正确的是 （ ）
A．ADC可通过主动运输进入肿瘤细胞
B．抗体进入细胞后激活溶酶体酶，导致细胞凋亡
C．单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合
D．肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，所以不会产生新的蛋白质
C

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