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(共39张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
本节聚焦:
1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
基因
表达载体
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植的过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫，不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。P76
转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）
科学家将苏云金杆菌的“杀虫基因”——Bt抗虫蛋白基因转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白（苏云金杆菌伴胞晶体蛋白）——破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？P76
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
导入
抗虫基因
（Bt抗虫蛋白基因）
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
实例：
具体的步骤是？
(含抗虫基因）
（含有并表达抗虫基因）
一
目的基因的筛选和获取
1.目的基因
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，就是目的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
也可以是具有调控作用的因子。
一
目的基因的筛选和获取
2.目的基因筛选
方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
随着测序技术的发展，以及序列数据库、序列比对工具等的应用，越来越多的基因的 为人们所知。
结构和功能
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
一
目的基因的筛选和获取
3.目的基因的获取
获取目的基因的方法：
①从基因文库中获取
②人工合成
③利用PCR获取和扩增目的基因
前提：
方法：
DNA合成仪
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制的 与 ，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
全称
原理
操作环境
目的
优点
PCR技术
一
目的基因的筛选和获取
PCR扩增仪
控制温度
解旋酶
DNA聚合酶
▲子链的延伸方向：
模板：
原料：
能量：
酶：
DNA的两条母链
4种游离的脱氧核苷酸
解旋酶、DNA聚合酶
复制特点:
①边解旋边复制 ②半保留复制
碱基互补配对原则
（保证复制的准确进行）
要点回顾:体内DNA复制
条件
5'端→3'端
复制原则:
因为 DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。
DNA复制所需的基本条件:
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（PCR用耐高温的DNA聚合酶）
（PCR用高温代替）
（PCR的引物2种）
引物是一小段能与 的一段碱基序列__________的____________
DNA母链
互补配对
短单链核酸
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
3’
5’
DNA母链
（通常20-30个核苷酸）
PCR技术
耐高温的DNA聚合酶
DNA模板
引物
缓冲溶液
四种脱氧核苷酸
PCR扩增仪（PCR仪）
条件:
微量离心管
——控制温度
（dNTP）
（2种）
一般添加Mg2+
（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）
PCR的条件：目的基因DNA（模板）、四种游离的脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、
引物、一定的缓冲溶液(维持反应体系的pH）、
Mg2+（激活DNA聚合酶的活性）、控制温度变化
PCR技术
基本过程
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
B.复性
（退火）
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
变性 复性 延伸
PCR技术
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮循环的产物
完成后，常采用 来鉴定PCR的产物。
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术
扩增结果：
以指数形式扩增，即____（n为扩增循环的次数）
2n
（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。
（2）若开始有N个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。
2n
N 2n
变性
90℃以上
延伸
72℃左右
复性
50℃左右
基本过程
DNA复制 PCR技术
场所
遵循原则
条件
解旋方式
酶
特点
结果
PCR技术 vs DNA复制
碱基互补配对原则
碱基互补配对原则
模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物
模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物(2种）
DNA在高温下热变性解旋
解旋酶催化
半保留复制、边解旋边复制
半保留复制、全解旋再复制
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶等
DNA连接酶
①全称：
②操作环境：
③原理：
④前提：
⑤条件：
⑥过程：
⑦优点：
聚合酶链式反应
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
可以在短时间内大量扩增目的基因（以指数形式扩增）
DNA半保留复制
已知目的基因的一段核苷酸序列（为了合成引物）
模板DNA、4种游离脱氧核苷酸、引物（1对）、耐高温的DNA聚合酶
变性：
复性：
延伸：
DNA解链（超过90℃）
引物结合到互补DNA链（50℃左右）
Taq酶从引物起始进行互补链的合成（72℃左右）
模板、原料、引物、酶、能量
（dNTP：d ATP、d TTP、dCTP、d GTP）
（本质？如何合成？）
引物是一小段核酸，能与DNA母链的碱基序列互补配对。
通常20-30个核苷酸，人工合成
回顾：PCR技术
热稳定的DNA聚合酶
（1）引物是一小段能与 的
短单链核酸，通常为20-30个核苷酸。
DNA母链的一段碱基序列互补配对
（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。
引物与目的基因模板链的 端结合。
从子链的5′端向3′端延伸
3′
【拓展练习】
1．PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？
不相同。但PCR反应时所用引物是人工加入的一小段DNA
体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA
思考讨论：
2．PCR过程中需要加入两种引物，原因是？
3．两种引物的要求？（理解）
DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，不能从头合成，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。
①引物自身不能环化
②两种引物之间不能互补配对
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合
PCR技术
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
过程
基因表达载体的构建
二
基因表达载体构建模式图
基因表达载体
重组
DNA分子
目的基因
DNA
限制酶
限制酶
DNA连接酶
载体
②能自我复制
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
载体应具备条件：
限制酶切割位点
标记基因
复制原点
基因表达载体中还应存在那些结构？
载体的种类：
质粒（常用）、噬菌体、动植物病毒
① ;
② 。
基因表达载体的构建
二
——核心步骤
基因表达载体由哪些部分组成
启动子：
位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录。
终止子：
位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段
终止转录
1.目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代
使目的基因能够表达和发挥作用
2.组成
标记基因：
目的基因：
复制原点：
鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞
注意：目的基因必须插入到 与 之间。
启动子 终止子
DNA复制的起始位点。
化学本质
基因表达载体中启动子、终止子的来源：
①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。
②如果目的基因是通过人工方法合成的，或是cDNA，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
重组DNA分子
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
DNA连接酶
基因表达载体构建模式图
限制酶
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
质粒
同种限制酶
或能产生相同末端的限制酶
？
基因表达载体的构建
二
——核心步骤
基因表达载体构建模式图
基因表达载体
3.过程
培育抗虫棉的简要过程
载体
自身环化
片段间
的连接
目的基因自身环化
质粒自身环化
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
目的基因
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何解决这一问题？
单酶切缺点：
思考：如果用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接
双酶切！
3 种
旁栏思考题
2. 将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？
有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气也无法确定哪些基因导入了受体植物。
将目的基因导入受体细胞
三
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
农杆菌转化法（常用）
基因枪法（单子叶植物常用）
花粉管通道法
2.将目的基因导入受体细胞的方法：
——显微注射法
—— Ca2+转化法
（我国科学家独创）
1. 转化的概念：
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内_____ 和_____ 的过程。
受体细胞
维持稳定
表达
花粉管通道法（我国独创）
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。
简便经济，但要求花朵较大
方法：
实例：
优缺点：
我国“转基因抗虫棉”
农杆菌转化法（常用）
能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种 植物也取得了成功。
农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的 可转移至被侵染的细胞，并整合到该细胞的 。
2.转化原理：
1.农杆菌的特点：
T-DNA
Ti质粒
大型环状DNA
农杆菌
T-DNA
染色体DNA上
单子叶
Ti质粒
构建基因表达载体时，目的基因该插到Ti质粒哪里？
T—DNA上
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
导入
植物细胞
目的基因
插入
植物细胞染色体DNA上
表达
新性状
转入
农杆菌
农杆菌转化法（常用）
3.过程：
植物组织培养
农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
①两次拼接:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。
第二次拼接(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的
染色体DNA上。
②两次导入:第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
1.显微注射法
科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。
2.病毒侵染法
导入动物细胞
——显微注射法
将含目的基因的表达载体提纯
受精卵
显微注射
含目的基因的受精卵
具有新性状的动物
雌性动物输卵管或子宫
胚胎移植
早期胚胎
细胞
处理大肠杆细胞
Ca2+
感受态
与感受态细胞混合
细胞吸收DNA分子
基因表达载体
使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。
注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
导入微生物细胞
—— Ca2+转化法
增加细菌细胞膜的通透性
因为没有内质网、高尔基体
对蛋白质进一步加工。
四
目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
——“抗原—抗体杂交技术”
2.个体生物学水平鉴定
1.分子水平检测
抗性检测：
功能活性比较：
PCR技术
或分子杂交技术
——检测目的基因在受体细胞中是否稳定维持和表达
——检测目的基因的表达产物
抗虫、抗病接种实验；
基因工程产品与天然产品的功能活性比较
利用专一性
——检测是否具有抗性以及抗性强度等
方法
如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法1：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
DNA半保留复制
原理：
四
目的基因的检测与鉴定
是否扩增出目的基因
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
电泳操作
引物如何设定？
原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
四
目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
酶切
转膜
标记的DNA/RNA探针
DNA分子杂交（Southern-blot)流程图
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
方法2：
DNA分子杂交技术
碱基互补配对
原理：
②检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增或分子杂交技术
转基因生物
提取RNA
RNA作为模板
PCR操作
电泳
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
四
目的基因的检测与鉴定
提取RNA
转膜
标记的DNA/RNA探针
RNA
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：
抗原与抗体的特异性结合
原理：
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
转基因生物
四
目的基因的检测与鉴定
放射性检测
（杂交带）
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
抗原— 抗体杂交技术
2.个体生物学水平鉴定
没有抗虫基因的棉花植株
有抗虫基因的棉花植株
棉铃虫没有死亡
棉铃虫死亡
接种
棉铃虫
四
目的基因的检测与鉴定
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
转Bt基因
非转基因
四
目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
——“抗原—抗体杂交技术”
2.个体生物学水平鉴定
1.分子水平检测
抗性检测：
功能活性比较：
PCR技术
或分子杂交技术
目的基因成功表达的标志：
合成相关蛋白质
抗虫、抗病接种实验；
基因工程产品与天然产品的功能活性比较
目的基因表达vs成功表达
——检测是否具有抗性以及抗性强度等
方法
基因工程的基本操作步骤
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
到社会中去
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。
（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物（非抗品种）轮作或套种等。
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
到社会中去

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