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(共32张PPT)
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第四章 基因工程
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第一节　基因工程赋予生物新的遗传特性
第3课时　基因工程的基本操作程序2
基因工程的基本操作步骤
获取目的基因
构建重组DNA分子
将重组DNA分子导入受体细胞
检测目的基因及其表达产物
目 录
将重组DNA 分子导入受体细胞
构建重组DNA分子（核心）
检测目的基因及其表达产物
（二）、构建重组DNA分子--核心
①用一定的限制酶切割表达载体（质粒），使其出现一个切口，露出黏性末端。
②用同一种限制酶切断目的基因DNA片段，使其产生同样的黏性末端。
③将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。
利用表达载体构建重组DNA分子
----核心
1.如何构建重组DNA分子？
那什么是表达载体呢？
克隆载体：用于大量扩增外源DNA的载体。
目的：克隆基因可以获得大量的DNA分子，不仅用于基因诊断、法医鉴定、判断物种亲缘关系等研究工作，还可以用于指导合成大量稀有的蛋白质产物，如胰岛素、干扰素和抗癌药物等。
2.克隆载体与表达载体
为什么要构建克隆载体？
许多外源DNA片段自身很难在受体细胞内成功复制，需要与含有复制起点的DNA分子相连
表达载体：使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体。表达载体包含适当的转录和翻译信号。
构建表达载体
的目的：
2）使目的基因能够表达和发挥作用。
1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以 遗传给下一代
复制原点：复制的起始点
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录
标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因
多个限制酶的识别序列：便于插入目的基因
3.基因表达载体的组成：复制原点+启动子+终止子+标记基因+多个限制酶的识别序列
思考：得到的一定是重组DNA分子吗？
载体（质粒）
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割
带有黏性末端（或平末端）的切口
带有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
4、构建重组DNA分子
含有目的基因的DNA片段
思考：如何防止质粒或目的基因自身环化呢？
基因两端用2种不同的限制酶切割，并用同样的2种酶切割质粒
用ＤＮＡ 连接酶连接时，可形成３ 种不同的连接物：
目的基因—载体连接物（正反向）
载体—载体连接物（自身环化）
目的基因—目的基因连接物（自身环化）
在构建重组DNA分子时,用同种限制酶剪切含有目的基因的DNA片段以及表达载体,然后用DNA连接酶将它们连接起来,形成重组DNA分子。在实际操作过程中可出现下图所示情况,据图回答问题。
“单酶切法”和“双酶切法”
1.黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接 3与4呢 为什么 此现象说明“单酶切法”具有什么缺点
2.黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接 此现象说明“单酶切法”具有什么缺点
提示 均能。因为同一种限制酶切割后形成的黏性末端互补(相同)。此现象说明“单酶切法”会导致质粒和目的基因的自身环化。
提示 均能。说明“单酶切法”会导致质粒与目的基因反向连接。
3.如何避免以上问题
提示 使用两种限制酶分别对目的基因和质粒进行切割(目的基因的两侧和质粒上含有这两种限制酶的酶切位点),且两种限制酶产生的黏性末端不同(不互补),这样能有效地避免质粒与目的基因的反向连接以及自身环化。
选择限制酶的方法
(1)根据目的基因两端的限制酶酶切位点确定限制酶的种类
①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的酶切位点)切割。
(2)根据质粒的特点来确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,
以确保具有互补的黏性末端。
②质粒作为表达载体必须具有标记基因等,
所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构。
(3)在重组DNA分子中,启动子应位于目的基因
的首端,终止子应位于目的基因的尾端,这样
目的基因才能表达,即酶切位点应位于启动子与终止子之间。
例题1.图甲、乙分别表示质粒和外源DNA,其中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列相关叙述正确的是(　　)
A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中,不能使用SmaⅠ切割
B.图甲所示的质粒分子在经SmaⅠ切割后含有4个游离的磷酸基团
C.为获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入DNA聚合酶
D.用EcoRⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以
A
例题2.在构建重组DNA分子时,需要选择合适的限制酶去切割表达载体和目的基因所在的DNA分子。下列相关叙述错误的是(　　)
A.可以选择同一种限制酶分别切割表达载体和目的基因所在的DNA分子
B.可以选择能产生相同末端的两种限制酶分别切割表达载体和目的基因所在的DNA分子
C.可以选择一种限制酶切割表达载体,另一种限制酶(产生的黏性末端与前一种不同)切割目的基因所在的DNA分子
D.构建重组DNA分子时,除了要用到限制性内切核酸酶之外,还要用到DNA连接酶
C
（三）、将重组DNA分子导入受体细胞
2、常用的受体细胞：接受目的基因的细胞，如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动、植物细胞等
3、导入方法：
1、含义：用适当的方法将形成的重组DNA分子转移到合适的受体细胞中。
（1）导入微生物细胞
——Ca2+处理法
② Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程
低温、Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞膜通透性
这种细胞称为感受态细胞
一般利用温度变化导入
①受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。
（1）将目的基因导入微生物细胞
低温将大肠杆菌与重组DNA分子混合，热刺激
①受体细胞：受精卵。因为受精卵容易表现出全能性。
②过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
（2）导入动物细胞
——显微注射法
显微操作仪
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
①易感染双子叶植物和裸子植物；
②内含Ti质粒，其上的T-DNA可转移至受体细胞的染色体DNA上。
农杆菌特点
（3）将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法（常使用）
（3）将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法（常使用）
植物组织培养技术
农杆菌感染植物细胞
重组Ti质粒转化农杆菌
Ti质粒上的T-DNA片段能整合到植物染色体DNA中
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入植物细胞染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2+处理法、感受态细胞法
受体细胞 体细胞、受精卵 受精卵 原核细胞
转化过程 将重组DNA分子→农杆菌→导入植物细胞→融合到受体细胞的DNA中得以表达 将重组DNA分子提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 CaCI2处理大肠杆菌细胞→大肠杆菌细胞的细胞膜的通透性改变→含有目的基因的重组质粒（DNA）进入大肠杆菌细胞
3、导入方法：
导入植物细胞：还有电击法、基因枪法与花粉管通道法
导入受体细胞后，目的基因是否可以稳定维持和表达其遗传特性呢？
检查基因工程是否成功
目的基因的检测与鉴定
四、检测目的基因及其表达产物
检测和鉴定的四个方面:DNA、RNA、蛋白质、个体性状
检测DNA
检测RNA、蛋白质以及个体水平上是否出现相应性状
1.检测目的基因是否稳定存在：
2.检测目的基因是否正确表达：
检测内容及形式：
(1)借助载体上的标记基因可以检测目的基因是
否在受体细胞中稳定地存在并遗传。
1.检测目的基因是否稳定存在：
例如，某些应用于大肠杆菌的质粒具有氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因两种标记基因。可使大肠杆菌具有青霉素抗性并能够合成β-半乳糖苷酶，该酶能催化无色的X-gal（5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷)分解为半乳糖和蓝色的5-溴-4-氯淀，使菌落呈现蓝色，将目的基因插入这种质粒上的LacZ基因中，使该基因失活，再将重组质粒导入大肠杆菌中，从而使含有重组DNA的大肠杆菌在含有X-gal和青霉素的培养基上形成白色菌落；而只导入不含目的基因的载体的大肠杆菌则形成蓝色菌落，不含有载体的大肠杆菌无法生长。
含重组DNA的大肠杆菌：白色
不含目的基因的载体的大肠杆菌：蓝色
不含有载体的大肠杆菌：不能生存
(2)利用PCR技术检测
更精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因的方法
根据目的基因的序列设计引物
利用待检DNA为模板进行PCR
通过电泳或DNA测序技术鉴定PCR产物
(3)利用核酸分子杂交技术检测
原理：两个不同来源核酸单链的核苷酸之间碱基互补配对
①核酸探针：是带有放射性或荧光标记的具有特定核苷酸序列的DNA或RNA
②过程：
使待检的DNA变性成单链并固定在硝酸纤维素膜上
加入探针
漂洗硝酸纤维素膜去除未互补结合的探针
检测硝酸纤维素膜的放射性或荧光
2.检测目的基因是否正确表达：
1.检测mRNA
------运用核酸分子杂交技术
2.检测蛋白质
------运用抗原-抗体杂交技术
3.个体水平
-----观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传
是判断转基因成功的直接证据
个体水平的鉴定
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
3.如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上怎么检测？如果目的基因是耐盐基因呢？
PCR技术和核酸分子杂交技术
用核酸分子杂交技术检测目的基因是否转录出mRNA；用抗原一抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出相应蛋白质
如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验；如果，目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。
1.用什么方法可以更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因？
2.用什么方法检测目的基因是否转录和翻译？
思考：
目的基因表达检测
是否转录检测——核酸分子杂交
是否翻译检测——抗原-抗体杂交
分子检测法
抗虫鉴定
抗病鉴定
活性鉴定等
个体水平的鉴定
目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中——核酸分子杂交，PCR,标记基因
基
因
工
程
的
基
本
操
作
程
序
获取目的基因
构建重组DNA分子
检测目的基因及其表达产物
表达载体
含有目的基因的DNA片段
CaCl2溶液处理
检测DNA
------- 化学合成法、基因文库、PCR
重组DNA分子
限制酶、DNA连接酶
将重组DNA分子导入受体细胞
农杆菌转化法
显微注射法
细菌
植物细胞
动物细胞
检测RNA、蛋白质、个体性状

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