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(共58张PPT)
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第四章 基因工程
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第一节　基因工程赋予生物新的遗传特性
第2课时　基因工程的基本操作程序1
目 录
获取目的基因的方法
原核细胞基因与真核细胞基因的结构异同
PCR技术和凝胶电泳技术
基因工程的基本工具：
限制性内切核酸酶、
DNA连接酶、
载体
基因工程的实质就是利用工具对基因进行操作
那基因的结构如何呢？原核基因和真核基因又有什么区别？
1.启动子：
2.终止子：
位于基因的“上游”，有RNA聚合酶结合的位点，控制转录的开始；
位于基因末端，当RNA聚合酶到达时，释放出RNA产物，转录结束。
真核、原核基因的结构
3.编码序列
（1）原核基因中编码蛋白质的序列是连续的
（2）真核基因中编码蛋白质的序列是不连续的。编码蛋白质的序列称为外显子，外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子。
不同基因的外显子和内含子的数目及长度是不同的。
（3）真核基因和原核基因的表达
1.真核基因的外显子和内含子均会被转录
2.真核细胞转录形成的RNA需要经过加工（切去内含子对应的部位），才可用于翻译
3.原核细胞转录形成的RNA，不需要加工，可直接用于翻译
基因结构
原核生物基因 真核生物基因
非编码区 位置
作用
主要结构
编码区
位于基因的两端
对基因的表达起调控作用
启动子
终止子
与RNA聚合酶结合，控制转录的开始
当RNA聚合酶到达时，释放出RNA产物，转录结束
核苷酸序列是连续的，转录出的mRNA可直接作为翻译的模板
核苷酸序列是不连续的，分为外显子和内含子，两者均会被转录成mRNA前体，再在核内切去内含子对应部分，加工成为成熟的mRNA。
启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学成分
位置
作用
DNA片段
mRNA上三个相邻碱基
DNA片段
mRNA上三个相邻碱基
目的基因首端
目的基因尾端
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部分，驱动基因转录出mRNA
决定转录的结束
翻译的起始信号
决定翻译过程的结束
基因工程的基本操作程序
获取目的基因、
构建重组DNA分子、
将重组DNA 分子导入受体细胞、
检测目的基因及其表达产物等。
（一）获取目的基因
1、目的基因：人们所需要的基因。如：人的胰岛素基因、植物的抗病基因等
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
目的基因
“杀虫基因”—Bt抗虫蛋白基因
（2）目的基因的序列已知：
从基因文库获得
（1）目的基因的序列未知：
2、获取方法：
根据蛋白质中氨基酸序列
根据mRNA中的碱基序列（逆转录法）
化学方法合成
已经给了目的基因：聚合酶链式反应（PCR技术）扩增
（受体菌群，每个受体菌含有一段不同的DNA片段）
①基因组文库：把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。
（1）目的基因序列未知
借助载体建立基因文库
（1）基因组文库
（2）cDNA文库
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
基因表达载体
导入受体菌中储存
基因组文库
②构建cDNA文库：从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA，然后在逆转录酶等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNA 。最后，借助载体，利用与构建基因组文库相同的方法构建cDNA文库，只包含了一种生物的部分基因。
由于基因的选择性表达，不同组织细胞的cDNA文库是不同的，同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异。例如，胰岛素基因的cDNA只能在由胰岛β细胞建立的cDNA文库中找到。
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
反（逆）转录酶
单链互补DNA
DNA聚合酶
双链DNA片段
与载体连接
基因表达载体
导入受体菌中储存
cDNA文库
真核细胞的cDNA的获取
编码区
非编码区
非编码区
DNA聚合酶
剪接有关的酶
RNA聚合酶
mRNA前体
mRNA
单链DNA
cDNA
逆转录酶
转录
剪接
逆转录
复制
启动子
终止子
基因
不含非编码序列。即不含非编码区和内含子
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间的基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去(含有不表达的内含子，这样获得的基因在原核生物体内不能表达)。所以此方法不适合获得真核生物目的基因的编码序列。
基因文库的构建——直接分离法（或鸟枪法）
DNA合成仪
①前提：基因比较小、核苷酸序列已知（适于合成序列较短的基因）
②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
（2）目的基因序列已知
1）化学合成法
目的基因的mRNA
逆转录
单链DNA
合成
双链DNA（目的基因）
蛋白质氨基酸序列
推测
mRNA的核苷酸序列
推测
结构基因的核苷酸序列
化学合成
目的基因
1）化学合成法
途径1：逆录法
途径2：根据已知氨基酸序列直接合成DNA
③过程
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
优点：简单、快速、灵敏
应用：医学鉴定、法医鉴定、古生物学研究
2）利用PCR技术扩增目的基因
前提:
要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。
（1）原理：
DNA半保留复制
（2）条件：
模板：
原料：
酶：
引物：
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
四种脱氧核苷三磷酸
（dNTP））
DNA模板
引物
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
DNA复制时，脱氧核苷酸链的延伸使用的原料只能是dNTP。DNA的合成需要能量，dNTP才能提供足够的能量，
过程：多次循环
92
55
75
℃
3`
5`
5`
3`
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
模板DNA
目的基因
PCR过程
92
55
75
℃
变性
3`
5`
5`
3`
第一轮
含有目的基因的双链DNA片段
氢键断裂，DNA解聚为单链
温度上升到90℃以上
变性
92
55
75
℃
退火
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第一轮
两条DNA单链
引物和两条单链DNA碱基互补配对
温度下降到50℃左右
复性
92
55
75
℃
延伸
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第一轮
引物和互补DNA结合
脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则合成新的DNA链
温度上升到72℃左右
延伸
92
55
75
℃
变性
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
92
55
75
℃
退火
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
92
55
75
℃
延伸
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
92
55
75
℃
变性
第三轮
92
55
75
℃
退火
第三轮
92
55
75
℃
延伸
第三轮
思考：继续循环N次，会得到多少个DNA分子呢？
DNA呈指数形式扩增。
①变性
②退火
③延伸
反应过程：模板DNA双链在高温下（90~95 ℃）氢键断裂，解旋成2条DNA单链
温度降低（50~60 ℃）后，2个引物分别与各自互补的DNA单链结合
分别以两条DNA单链为模板，4种脱氧核苷三磷酸为原料，耐高温的Taq DNA聚合酶在适宜的温度（约72℃）下，以引物与模板形成的小段DNA双链区为起点，催化合成一条新的DNA互补链。
（3）过程：
（包括多次循环）
PCR的引物
引物其实就是引子，是一小段单链DNA（体内DNA复制所用的引物是RNA），是作为DNA复制的起始点，决定PCR扩增产物的特异性和长度。
1.概念
2.引物的长度
其长度常用的是15～30个脱氧核苷酸
因为过短则特异性低。过长的引物会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
3.引物的种类
PCR扩增时应有两种引物，即分别能与两条模板链配对的两种单链DNA。
4.结合位点
由于DNA复制只能是5'→3 '进行，而DNA的两条单链又是反向平行的。
5.设计引物的要求
引物是复制时所要合成的新链中的一段，在整个PCR周期都一直存在（体内DNA复制因用的引物是RNA，最后是被DNA聚合酶I切除的）。
要考虑长度、G/C碱基对的数目外，还要避免两个引物（特别是3’端）间发生互补，避免引物内部出现二级结构等。
6.引物数量要求
模板链的3’端
例题：1.设计引物是 PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（图 1），请分别说明理由。
①第1组： ；
②第2组： 。
引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2.采用PCR技术扩增HSA基因。图3中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
思考：
（1）PCR技术中DNA双链解旋的原理与体内DNA复制相同吗？为什么？
（2）PCR扩增的DNA片段大小由什么决定？
扩增DNA片段的起点和终点由2个引物决定
PCR技术具有简便、快速、灵敏的特点,已广泛应用于医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面。下图表示PCR的前三个循环,目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间,请据图回答下列问题。
PCR技术扩增过程
1.细胞内DNA复制时是否需要引物 为什么
提示 需要。因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链,只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3'端,所以细胞内DNA复制时需要引物。
2.PCR过程中,如果两种引物之间互补序列较长,会有什么样的结果
提示 可能会导致在退火过程中,引物之间相互结合,从而使引物不能很好地与模板DNA链结合。
3.PCR过程中,退火的目的是什么
提示 使2个引物分别与各自互补的DNA单链结合。
4.PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗
提示 不是,PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
5.经过第几轮扩增后,扩增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端 比例是多少
提示 第三轮。1/4。
6.如果已知某目的基因的序列和结构,利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么
提示 根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
讨论
1.目的基因双链DNA片段在第 次循环后出现。
2.第n次循环后共有 个分子。这些分子可以分为3种类型：目的基因双链DNA片段为
个，双链中有1条链长于目的基因的DNA片段为 个，双链均长于目的基因的DNA片段有 个。
3.共进行n轮循环，总共消耗引物A的数量
个。第n轮循环后，含有引物A的DNA数量 个。
三
（2n-2n）
2（n-1）
2
2n
2n-1
2n-1
利用PCR技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA复制类似，如图所示。图中引物为单链DNA片段,它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测,第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
② 在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
15/16
三
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式
场所
酶
引物
温度
结果
联系
解旋酶催化
DNA在高温下变性解旋
主要在细胞核内
细胞外
解旋酶、DNA聚合酶
热稳定Taq DNA聚合酶
细胞内温和条件
3个温度，需在不同温度下进行
合成整个DNA分子
扩增特定的DNA片段或基因
(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板
(2)原料：均为四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）
(3)酶：均需DNA聚合酶
(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
RNA、最后切除
单链DNA、始终存在
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
（4）产物鉴定的方法
------电泳技术
核酸带负电（含磷酸基团），其移动速率主要受核酸片段长度的影响。在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极移迁速率越慢。电泳时常使用凝胶作为介质，凝胶的孔隙可起到
分子筛的作用；凝胶浸没于电泳缓冲液中。
电泳缓冲液的作用是在电泳过程中维持合适
的PH，并使溶液具有一定的导电性，
利于核酸迁移。
每个条带包含的DNA片段长度是相同的
DNA相对分子质量标准物---作为参照物
亚甲基蓝将DNA染成蓝色
分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的方法
DNA本身是无色的，可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用亚甲基蓝将DNA染成蓝色。
含有DNA条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA，从而达到提纯的目的。核酸分子大小采用碱基对数进行描述。DNA相对分子质量标准物（DNA Marker）是一组已知长度的和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中能作为参照物。不同的DNA Marker所含的DNA片段的长度和含量是不同的。
利用电泳技术鉴定PCR扩增产物
一、实验原理：
活动·PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
（1）PCR 经过多次循环______、_______、_______三个步骤，可获得大量目的基因或DNA片段。
（2）PCR 技术扩增的酵母细胞中编码核糖体 RNA的DNA部分片段，长度为841 bp，通过______________进行鉴定。
（3）PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；
变性
退火
延伸
琼脂糖凝胶电泳
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
DNA半保留复制
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是电泳。
可解离的基团
带电分子
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关
④凝胶中的DNA分子使用 进行染色，再用 以及蒸馏水 ，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
亚甲基蓝溶液
75%酒精
脱色
DNA分子的大小
构象
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头
电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
4种脱氧核苷三磷酸的等量混合液、2种引物
TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、
电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、
琼脂糖和核酸染料等
琼脂糖凝胶电泳装置
PCR仪
2.材料用具
1.微量移液器枪头、微量离心管使用前需进行高压蒸汽灭菌。
2.扩增缓冲液（含 Mg2+)，增强Taq酶的活性
4.上样缓冲液(loading buffer)；内含甘油可以增加样品密度，确保DNA能够沉入加样孔内；含有少许溴酚蓝作为电泳指示剂，电泳时溴酚蓝迁移速率较快，在其迁移出凝胶前关闭电泳仪电源。
5.0.1%亚甲基蓝溶液：称取0.1g亚甲基蓝溶于100mL蒸馏水中。避免接触皮肤和眼睛，避光保存。
3.市售2U/uL TaqDNA聚合酶(U为酶活力单位，定义为30℃、最适pH、底物浓度饱和的条件下，1min转化1umol底物所需要的酶量)
3.方法步骤
（1）PCR 扩增
①使用___________将PCR体系各成分加入0.2 mL已灭菌的微量离心管中。
②以 3 000 г/min的转速离心____,使反应液集中于微量离心管的底部。
③将微量离心管放入_______中，设置反应条件.扩增后的PCR产物可储存在_______条件下。
微量移液器
30 s
PCR仪
-20 ℃
（2）琼脂糖凝胶电泳
①制备琼脂糖凝胶
②加样
③电泳
制备琼脂糖凝胶：
溶化：称取琼脂糖0.25g，加到盛有25ml电泳缓冲液的三角瓶中。将三角瓶盖上封口膜并用橡皮筋绑住后，用微波炉或沸水浴加热，使琼脂糖溶化呈透明状。
倒模：将琼溶化的脂糖倒入胶盒，若琼脂糖中有气泡，可用枪头除去气泡。
凝固：待凝胶完全凝结，小心拔出梳子，凝胶上梳齿的位置成为加样孔。
加液：将装有凝胶的胶托从胶盒中取出，放入电泳槽内，加样孔一端朝向负极，向电泳槽中加入电泳缓冲液，使其没过凝胶。
加样：用微量移液器向50μ LPCR产物中加入10μ L 6×上样缓冲液，并反复吹吸混合均匀。将20μ L样品混合液缓慢加到加样孔内（留第一个加样孔加 DNA Marker与上样缓冲液）。将20μ L DNA Marker与4μ L 6×上样缓冲液混合均匀，全部加到加样孔内。每加样一次需更换一次枪头.
电泳：盖上电泳槽盖，连接好电极插头后再接通电源。将直流电泳仪的电压设置成80V，开始电泳。25min后关闭电源，停止电泳。注意观察溴酚蓝不要迁移出凝胶。
方案一：将凝胶放入培养皿，倒入0.1%亚甲基蓝溶液，没过凝胶约5mm，染色8min。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间，不要留有气泡。染液使用后可回收利用。倒入75%酒精没过凝胶约5mm，不断晃动培养皿1~1.5min。再倒去酒精。加入冷的蒸馏水进行脱色。当出现清晰的蓝色区带时，倒去蒸馏水终止脱色。此过程中可更换被染蓝的蒸馏水。如果浸泡过久，颜色变淡直至无色
(3)染色
方案二：向盛有凝胶的培养皿中倒入0.002%亚甲基蓝溶液，没过凝胶约5mm。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间。盖上培养皿盖，4℃冷藏过夜第二天观察到清晰的蓝色区带时，倒去染液，终止染色。染液可回收利用。
(4)观察
①在桌上铺一张白纸，在光下手持盛有凝胶的培养皿距白纸5 cm以上，找到较为清晰的条带。蓝色条带即为DNA所在位置，注意观察条带的数目和位置。再将凝胶置于平的透明玻璃板上，放在三脚架上面进行观察并拍照。
②用直尺紧贴凝胶表面测量DNA条带迁移距离，即每个DNA条带中央到加样孔的距离，记录于表中。根据已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度，推测PCR产物长度。
结果分析与评价
观察蓝色条带的数目和位置，通过和Marker对比来判断扩增的结果。
模板被污染、引物设计不合理、退火温度过低、DNA聚合酶质量不好等。
除了不加酵母细胞悬液外，其成分和其他微量离心管一样。（阴性对照）
3.PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定实验活动的对照组应该如何设计？
1.判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？
2.如果扩增条带不止一条，可能的原因有哪些？
获
取
目
的
基
因
基因的结构
----原理、条件、过程
方法
活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
真核基因
原核基因
化学合成法
基因文库
PCR
基因组文库
cDNA文库

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