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第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程(1)----动物细胞培养
细胞工程
植物体细胞杂交
植物组织培养
动物细胞融合
动物细胞培养
动物体细胞核移植
动物细胞工程
植物细胞工程
单克隆抗体制备
学习目标
治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会存在免疫排斥反应。
那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤呢？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出人的皮肤呢？
克隆皮肤
从社会中来
其中动物细胞培养是最基础的技术。
动物细胞培养技术
从动物体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖。
胚胎或幼龄动物的细胞较成体的细胞更易培养
动物细胞工程的基本技术
细胞增殖
人造皮肤
地位
原理
培养对象
动物细胞培养①概念
目的
获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。
那么，获得这些细胞或细胞产物的具体过程又是怎样的？
动物细胞培养②过程
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
单个细胞
细胞 悬浮液
10代
细胞
少部分突破细胞寿限“癌变”，无限传代
动物细胞培养不能最终培养成动物体
50代细胞
原代培养
传代培养
细胞贴壁
剥离、分瓶
细胞
分化程度低，增殖能力强
去掉组织间蛋白质
加培养液
胰蛋白酶/
胶原蛋白酶
剪碎
(机械方法)
(细胞贴壁长成单层细胞,出现接触抑制)
原代培养
CO2培养箱中培养
传代培养
大多数细胞
有些细胞可悬浮培养
取动物组织
制成细胞悬液
动物细胞培养的特点
接触抑制
贴壁生长
分瓶培养（传代培养）
悬浮的细胞离心收集
贴壁的细胞用蛋白酶处理
收集
动物细胞培养②过程
培养过程中出现了几个特点：
要求：（培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附）
细胞的接触抑制
（1）细胞贴壁—
悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生长的现象；
（2）接触抑制—
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象
动物细胞培养②过程
动物细胞培养②过程
思考讨论:
（1）培养前为什么分散成单个细胞？
①成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖
②利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应和代谢物及时排出。
（2）将组织分散成单个细胞时为什么要用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）处理？胃蛋白酶可以吗？
胰蛋白酶可以将动物组织细胞间的蛋白质成分酶解，使细胞分散开，获得单个细胞。
胃蛋白酶不可以，pH不适宜。
（3）在用胰蛋白酶处理组织时应注意什么？
纤维蛋白、胶原蛋白等
细胞膜含有蛋白质，长时间处理会损伤细胞
要控制好时间
动物细胞培养②过程
思考讨论:
如何鉴定原代培养和传代培养？细胞株和细胞系？
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
无限传代
原代培养
传代培养
细胞株
细胞系
遗传物质改变
遗传物质有的改变
洗涤、稀释、分瓶培养
多数细胞固定在表面生长和分裂
随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖
动物细胞培养②过程
思考讨论:
如何鉴定原代培养和传代培养？细胞株和细胞系？
将动物组织处理后的初次培养（10代内）。
原代培养：
当原代培养的细胞贴满瓶壁时，重新用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁脱落，加培养液制成细胞悬液，分装到2个或2个以上的培养瓶中继续培养（10代后）。
传代培养：
原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。
细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。
细胞系：
区别：
细胞株：
欲使动物细胞体外培养顺利进行，应营造怎样的环境？
动物细胞培养③条件
动物细胞培养所需的基本条件
营养条件
其他条件
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
糖类、氨基酸、无机盐、维生素……
I. 营养
将细胞所需的营养物质按照种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基
使用合成培养基时，（因为对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚）通常需要加入血清等天然成分
培养动物细胞一般使用液体培养基，也叫培养液
动物细胞培养③条件
无菌、无毒的环境
无菌操作(培养液和所有培养用具灭菌处理)
添加一定的抗生素
定期更换培养液清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
温度、pH和渗透压
温度多 36.5±0.5℃（哺乳动物）
pH 7.2～7.4
气体环境
O2是细胞代谢必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
通常将培养皿或松盖培养瓶置于95%空气＋5%CO2的混合气体CO2培养箱中培养。
动物细胞培养③条件
为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？
补充资料：
1、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，
2、氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物
细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。
3、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未
知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的
生长、增殖和贴附。
4、因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加
10%～20%的血清。
血清中含有多种未知的促细胞生长因子等营养物质，这是细胞生长和增殖所必需的。
动物细胞培养
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
细胞的全能性
细胞增殖
固体培养基
液体培养基
蔗糖、植物激素
葡萄糖、动物血清
植物体
大量动物细胞
快速繁殖、培育无病毒植株
获得细胞或细胞分泌蛋白
动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？
动物细胞培养
动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
细胞的全能性
细胞增殖
固体培养基
液体培养基
蔗糖、植物激素
葡萄糖、动物血清
植物体
大量动物细胞
快速繁殖、培育无病毒植株
获得细胞或细胞分泌蛋白
相同点：培养基中都需要加入营养物质、培养过程中都需要防止杂菌污染、都需要提供适宜的温度、pH和渗透压的条件。
植物细胞(如愈伤组织细胞) 培养时，也需分散成单个细胞，制成细胞悬液用液体培养基培养。
培养基的不同之处：
1.液体培养基；2.葡萄糖；3.动物血清
干细胞
胚胎干细胞
成体干细胞
成体组织或器官内的干细胞，具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的潜能。
存在于早期胚胎中，也叫ES细胞。具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和甚至器官的潜能。
成体
干细胞
骨髓、外周血和脐带血中：造血干细胞
血 细 胞
神经系统中：神经干细胞
睾丸中：精原干细胞
神经细胞
精原细胞
分化
分化
分化
干细胞培养及其应用
干细胞培养及其应用
干细胞与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
移植
修复或替换
正常
干细胞
患者
体内
受损的器官或组织
治愈疾病
正常的造血干细胞
移植
患者体内
修复或替换
受损的血细胞
治疗
白血病
造血系统、免疫系统功能障碍疾病
神经组织损伤和神经退行性疾病
帕金森病、阿尔茨海默病
正常的神经干细胞
移植
患者体内
修复或替换
受损神经组织
治疗
干细胞培养及其应用
2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它成为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），之后用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。2007年，科学家通过类似的方法成功诱导出人类的iPS细胞。
体细胞
永生化
iPS细胞
细胞衰老
肿瘤细胞
c-Myc
Klf4
Oct3/4
Sox2
Klf4
科学家利用逆转录病毒将4种基因转入小鼠或人的体细胞中表达，体细胞可诱导转变为类胚胎干细胞。
iPS细胞存在导致肿瘤发生的风险，导致iPS细胞无法在短期内进入临床应用。
c-Myc作为原癌基因，一方面促进细胞的自我更新，另一方面也增加了细胞的成瘤性。
成纤维细胞
T细胞和B细胞
iPS
细胞
导入特定基因
导入特定蛋白
小分子化合物诱导
治疗心血管疾病
治疗阿尔茨海默病
①诱导过程无需破坏胚胎。
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
干细胞培养及其应用
干细胞培养及其应用
2006年，利用逆转录病毒载体将四个基因的组合转入已分化的小鼠胚胎或成体成纤维细胞，获得小鼠iPS细胞。2012年获得诺奖。
2007年，Jaenisch研究组用iPS细胞来源的造血前体细胞成功治疗小鼠镰刀状红细胞性贫血，这项研究从理论和实践上为人类单基因遗传病的治疗奠定了基础。
01
02
iPS细胞研究历史（标志性事件）
2009年，中国科学家周琪和曾凡一研究组由iPS细胞培育出了具有繁殖能力的小鼠：”小小”。在世界上首次证明了iPS细胞的全能性。由此，iPS细胞的研究进入了新纪元。
03
2008年，Ying Shao Yao 研究组报道，将皮肤癌细胞重编程为iPS细胞，该研究开辟了一条获得iPS细胞的新途径。
04
2013年，中国科学家邓宏魁研究组用四种小分子化合物组合诱导小鼠体细胞重编程为可分化发育为各种组织器官类型的多潜能干细胞，邓宏魁研究组将其命名为CiPS。该成果向制备无遗传修饰的iPS细胞方面迈出了一大步，开辟了一条全新的实现体细胞重编程的途径，给未来应用再生医学治疗重大疾病带来了新的可能。
2014年，科学家利用能发育成多种细胞的诱导多功能干细胞(iPS细胞)制成视网膜细胞，并移植到一名70多岁的渗出型老年黄斑变性女患者的右眼中。这是世界首例利用iPS细胞完成的移植手术。
05
06
干细胞培养及其应用
iPS细胞研究历史（标志性事件）
干细胞培养及其应用
iPS细胞研究历史（标志性事件）
2018年，中国科学家丁胜研究组，通过靶向技术激活內源基因，可成功实现体细胞多功能性的诱导，获得iPS细胞。该研究不仅提供了一种构建诱导性多能干细胞的方法，也帮助人们更好地理解了表观遗传修饰调控细胞命运的机制。
07
2021年，科学家借助基因技术，修改了iPS细胞中的基因，成功培养出只攻击癌细胞的T细胞，其效果已在小鼠实验中得到确认，朝着癌症免疫疗法实用化更进一步。
08
动物细胞培养的应用
用于生物制药
如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等
用于检测有毒物质
用于生理、病理、药理方面的研究
如用于筛选抗癌药物等
下列属于动物细胞培养与植物组织培养区别 (　　)
A. 动物细胞培养所用的培养基的成分与植物的不同
B. 动物细胞培养不需要在无菌条件下进行
C. 动物细胞培养过程中可发生基因重组，而植物组织培养不能
D. 植物组织培养和动物细胞培养都体现了细胞的全能性
A
课堂检测
在将动物组织块分散成单个细胞时，可以使用胰蛋白酶。由此不能推测出来的是 (　 　)
A. 动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系
B. 胰蛋白酶可能会对动物细胞造成损伤
C. 处理时一定要注意处理时间、加酶量
D. 换用胃蛋白酶也能起到相同的作用
D
胃蛋白酶的最适pH值为1.5~2.0。而细胞所生存的环境近中性，在此条件下胃蛋白酶变性失活无法起作用。
课堂检测
某医院接生了一名婴儿，医院为他保留了脐带血，若后来他患了胰岛素依赖型糖尿病，就可以通过脐带血中的干细胞为其治疗。关于这个实例说法正确的 ( 　　)
A. 用干细胞培育出人体需要的器官来治疗疾病，需要激发细胞的所有全能性
B. 用脐带血干细胞能治疗这个孩子的所有疾病
C. 如果要移植用他的干细胞培育出的器官，需要用到细胞培养技术
D. 如果要移植用他的干细胞培养出的器官，应该长期给他使用免疫抑制药物
C
课堂检测
（2）培养先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和______________等。当细胞分裂生长到__________时，就会停止增殖，需用胰蛋白酶处理后分瓶继续培养，称为_________。
（3）有一类不正常的动物细胞，体外培养不受接触抑制机制的制约而表现为“疯长”，这类细胞最可能是________。
左图为动物细胞培养过程示意图，请回答以下几个问题：
（1）容器A中的动物器官或组织首先要剪碎，然后用胰蛋白酶处理，其目的是 ______________________；
使组织分散成单个细胞
传代培养
动物血清
癌细胞
相互接触
课堂检测
小结
动物细胞培养的条件
干细胞的培养和应用
动物细胞培养
动物细胞培养的过程
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
iPS细胞的培养和应用
制备细胞悬液
原代培养
传代培养

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