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第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程(2)----动物细胞融合与单克隆抗体的制备
细胞工程
植物体细胞杂交
植物组织培养
动物细胞融合
动物细胞培养
动物体细胞核移植
动物细胞工程
植物细胞工程
单克隆抗体制备
学习目标
旧知复习
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
植物体细胞杂交技术跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出新的作物类型。　　　　　
思考:有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞优势于一身的动物细胞呢？
1970年荧光标记的人-鼠细胞融合实验模式图
实例：
如果让动物细胞进行融合，与植物有哪些不同之处？
思考：
无需去除细胞壁
全能性受限制，不能培育成新的动物个体
动物细胞融合
时间 成果
19世纪30年代 观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞
1858年 观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。
1875年 第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。
1876年 在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。
1962年 日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。
1965年 英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合
1974年 华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。
1975年 Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
20世纪80年代 发展出了电融合技术(1985年酵母原生质体电融合)
补充资料：动物细胞融合技术的发展历史
将两个或多个动物细胞融合成一个杂交细胞的技术。
细胞膜的流动性
原理
发展出杂交瘤技术
制备单克隆抗体
应用
诱导因素
PEG融合法
电融合法
灭活的病毒诱导法
(动物细胞融合特有)
形成杂交细胞。即融合后形成的原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。
结果
动物细胞融合
意义
①突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
②成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。
③利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
动物细胞融合
问题：诱导融合后的细胞一定具有双方的遗传信息吗？
为什么？
不一定，诱导A、B两种细胞融合，融合后可能有A、B未融合细胞及AA、AB、BB等多种细胞，因此细胞融合后需要进行筛选。
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
灭活：用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病毒的抗原结构。
细胞融合的过程
两种细胞→物理、化学或生物诱导→融合(膜融合→质融合→核融合)
动物细胞融合
利用细胞融合进行基因定位
已知人的体细胞和小鼠的体细胞(2N=40) 杂交(融合)后，杂种细胞在有丝分裂过程中，人的染色体逐渐地丢失，最后仅保留少数几条。由于人染色体的丢失是随机的，因此不同的杂种细胞会保留不同的人染色体。
结论：人胸苷激酶基因位于17号染色体上。
动物细胞融合
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
融合前处理
诱导融合的方法
意义和用途
克服远源杂交的障碍，
获得杂种植株
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性
植物细胞的全能性
去除细胞壁后诱导原生质体融合
使细胞分散后诱导细胞融合
物理（离心、振荡、电激）化学（ PEG ）
物理、化学方法（ PEG ）
灭活的病毒
制备单克隆抗体
动物细胞融合
讨论
1.血清抗体有什么缺点？
2003年爆发SARS期间及2020年爆发的COVID-19期间，医生通过临床输注康复者或恢复期的患者血浆制成的免疫球蛋白预防病毒的入侵。
抗原不纯
抗体不纯
缺陷： 产量低、纯度低，
且抗体的特异性差、灵敏度低。
不能无限增殖产生大量抗体
动物体内
抗原
刺激
浆细胞
抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
过渡:传统抗体的缺陷
单克隆抗体的故事
１）体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上
２）每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体
1、科学家发现：
单
克 隆
抗 体
一个
B淋巴细胞
抗体
细胞群
克隆
如何获得大量、单一的抗体？
体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖
2、需解决问题：
3、遗憾：
如何解决这一难题？
癌细胞
１.我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的
２.有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和无限增殖能力同时具备
思考：
动物细胞融合
一个极富创造力的方案：
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
单克隆抗体的故事
由单一B淋巴细胞克隆产生的特异性强的抗体。
特异性强，灵敏度高，可大量制备
特点
运载药物
“生物导弹”=
单克隆抗体+药物
应用
作为诊断试剂
治疗疾病
单克隆抗体①概念②应用
注射特定蛋白免疫小鼠
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
多种融合细胞
融合
融合
单克隆抗体③制备过程
单克隆抗体③制备过程
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
选择培养基筛选
克隆化培养
专一抗体检测
筛选
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
单克隆抗体
单克隆抗体
体内培养
体外培养
大量制备
单克隆抗体③制备过程
注射特定蛋白免疫小鼠
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
多种细胞
↓
↓
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
↓
融合
↓
选择培养基筛选
克隆化培养
专一抗体检测
体内培养
体外培养
单克隆抗体
单克隆抗体③制备过程
单克隆抗体③制备过程
补充资料：第一次筛选获得杂交瘤细胞
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法？
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
合成DNA
D途径
S途径
D途径
氨基喋呤
A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3
选择性培养基：
在该培养基上，_______________细胞和____________________的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。
未融合的亲本
融合的具有同种核
单克隆抗体③制备过程
阳性孔
在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养 （克隆化培养）
一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔
多孔细胞培养板
抗体检测板
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法
两次
筛选
第一次筛选
第二次筛选
目的：
方法：
目的：
方法：
筛选出融合的杂种细胞(杂交瘤细胞 )
这种杂种细胞既能无限增殖，又能产生专一性抗体。
特定的选择性培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。
筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选。
单克隆抗体③制备过程
选择培养基筛选
单克隆抗体
诱导融合
注射特定蛋白免疫小鼠
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
选择培养基筛选
专一抗体检测
注射到小鼠
腹腔内增殖
体外培养
注射特定蛋白免疫小鼠
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
克隆化培养
专一抗体检测
注射到小鼠
腹腔内增殖
体外培养
课堂检测
单克隆抗体④应用
利用放射性同位索标记的单克隆杭体，在特定的组织中成像的枝术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
作为诊断试剂
用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，灵敏度很高，在妊娠的第８天就可以做出诊断，比原来的诊断方法提前了10天左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90％以上。
实例1：早早孕检测试纸(条)
具有准确、高效、简易、快速特点.
诊断优点：
原理：
抗原-抗体杂交法
在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。
单克隆抗体④应用
病毒蛋白的检测依赖抗体。只要找到了亲和力足够高，特异性足够好的抗体，就可以省去提取病毒RNA的繁琐步骤，直接用发病期患者的血清或痰液进行蛋白免疫分析，在短时间内就可得到结果。
用抗原免疫动物(兔、鼠等)，对动物的免疫细胞进行筛查，找到能用来生产高特异性抗体的淋巴细胞，对其进行扩增，得到可用的单克隆抗体。
相比基于RNA的PCR试剂盒(核酸检测)，蛋白检测试剂盒所需的开发时间要更长，生产成本要更高。而且具有滞后性，不能及时检测出是否感染病毒。
准确、高效、简易、快速
实例2：2019-nCoV检测：抗原-抗体检测
单克隆抗体④应用
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
单克隆抗体④应用
用于治疗疾病和运载药物
单克隆抗体主要用于癌症治疗，也有少量用干其他疾病的治疗。单抗药物剂型种类繁多，有单独使用的，也有与同位素、毒素、药物结合使用的。
②用于疾病检测
甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为______免疫小鼠，制备__________________，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的______会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在______上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。
抗原
抗AFP单克隆抗体
AFP
肿瘤
资料：使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。
ADC示意图
问题：细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害。
解决方法：抗体—药物偶联物(ADC)，将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。
抗体
药物
接头
(主要用于癌症治疗)如：单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
优点：位置准确、疗效高、副作用小
(“生物导弹” —单抗导向，药物为弹头)
单克隆抗体④应用
ADC的作用机制示意图
①
ADC
②
③
④
溶酶体裂解
释放药物
⑤
细胞凋亡
(主要用于癌症治疗)
如：单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
优点：位置准确、疗效高、副作用小
(“生物导弹” —单抗导向，药物为弹头)
单克隆抗体④应用
小结:单克隆抗体
下列关于细胞工程的叙述，错误的是 (　 　)
A. 电融合法可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合
B. 去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理
C. 小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫的小鼠B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体
D. 培养人的浆细胞能产生单克隆抗体
D
课堂检测
单克隆抗体制备过程中使用的骨髓瘤细胞是一种缺陷型细胞，在含有次黄嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶的培养基(HAT)中无法生长；而小鼠B淋巴细胞是正常细胞，在HAT培养基上可正常存活。用聚乙二醇诱导细胞融合后，经过数代培养，最终可在HAT培养基上存活的细胞是 (　　)
A. 骨髓瘤细胞之间形成的融合细胞
B. B淋巴细胞之间形成的融合细胞
C. 骨髓瘤细胞与B淋巴细胞之间形成的融合细胞
D. B淋巴细胞
C
课堂检测
科学家将经过羊红细胞免疫过的小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞，并能分泌单克隆抗体。羊红细胞和B淋巴细胞在该实验中分别属于 (　　 )
A.癌细胞和记忆淋巴细胞
B.抗原物和浆细胞
C.特定抗体物和记忆淋巴细胞
D.癌细胞和浆细胞
B
单克隆抗体制备过程中所提到的B淋巴细胞实际上是浆细胞
课堂检测
为研制抗新型冠状病毒的单克隆抗体，某研究性学习小组以兔子甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：
（1）为了得到能产生抗新型冠状病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1的培养基中进行细胞培养的结果是________________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是__________________________。
（2）单抗特异性比一般抗血清强，原因是一般抗血清中的抗体是______________________________________。
（3）若要使能产生抗新型冠状病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，通常采用的方法有________________________ ___________________________________。
一群识别不同抗原部位的抗体混合物
将杂交瘤细胞体外培养、
抗原与抗体特异性反应
只有杂交瘤细胞能够生存
将杂交瘤细胞注射到兔子腹腔内增殖
课堂检测

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