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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
第2课时 微生物的选择培养和计数
1. 通过实例,理解各类微生物都能适应其生活环境的原理。(生命观念)
2.根据微生物的代谢类型,配制选择培养基,总结分离微生物的过程和测定微生物数量的常用方法。(科学思维)
3.通过对土壤中分解尿素的细菌进行分离和计数,理解并掌握微生物计数的方法。(科学探究)
一、选择培养基
1.概念:在微生物学中,允许特定种类的微生物生长,同时　 　其他种类微生物
生长的培养基。
2.实验室中微生物的筛选原理:人为提供　 　(包括营养、温度
和pH等),同时提供抑制或阻止其他微生物生长的条件。
抑制或阻止
二、微生物的选择培养
1.方法:对土样进行充分稀释,然后用涂布器将　 　均匀地涂布到制备好的　 　
培养基上,这样就可以将聚集在一起的细菌分离开来。
有利于目的菌生长的条件
菌液
选择
2.稀释涂布平板法的操作过程”
(1)系列梯度稀释操作:
(2)涂布平板操作:
①取菌液:取　 　菌液,滴加到　　 。
0.1 mL
培养基表面
②涂布器灭菌:取出浸在　　 中的涂布器,放在　 　上灼烧,待酒精燃尽后,　
　涂布器。
③涂布:用涂布器将菌液　 　地涂布在培养基表面,涂布时可　 　培养皿,
使涂布　 　。
火焰
3.培养:待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板　 　,放入　 　中培养1~2 d,观察。
酒精
冷却
均匀
均匀
转动
倒置
恒温培养箱
三、 微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法
(1)原理:当样品的　 　 足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释
液中的一个　 　。通过统计平板上的　 　,就能推测出样品中大约含有多少
活菌。
(2)计数原则:平板上菌落数应为　 　,在同一稀释度下,应至少对　 　个平板进行
重复计数,然后求出　 　。
(3)不足:当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是　 　个菌落,所以统计的菌
落数往往比活菌的实际数目　 　。
稀释度
活菌
菌落数
30~300
3
平均值
一
少
2.显微镜直接计数法
(1)计数工具:显微镜、细菌计数板或血细胞计数板。
(2)不足:由于计数结果是活菌数和死菌数的总和,因此一般计数结果比活菌的实际数目　 　。
四、 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.原理:绝大多数微生物都能利用葡萄糖,但是只有能合成　 　的微生物才能分解尿素。利用以　 　作为唯一氮源的选择培养基,可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
多
脲酶
尿素
2.实验设计
(1)土壤取样:从酸碱度接近中性且潮湿的土壤中取样。铲
去表层土,在距地表　 　cm的土壤层取样。
(2)样品的稀释:测定土壤中细菌的数量,一般选用　 　 倍稀释的稀释液进行平板培养。
(3)微生物的培养与观察:细菌一般在　 　℃的温度下培养　 　d。每隔　 　h统计一次菌落数目,选取菌落数目　 　时的记录作为结果。
3~8
1×104、1×105和1×106
1~2
30~37
稳定
24
任务1 对分解尿素的微生物进行分离和计数
活动1 选择培养基
下表是本任务使用的培养基的配方,根据配方配制培养基,分析并回答以下问题:
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
1.从物理性质上看,此培养基属于哪种类型的培养基 判断依据是什么
2.从功能上看,此培养基属于哪种类型的培养基 此培养基是如何实现其功能的
提示 此培养基从物理性质上看属于固体培养基,因为加入了凝固剂(琼脂)。
提示 此培养基从功能上看属于选择培养基。此培养基的氮源只有尿素,只有能分泌脲酶的微生物才可利用尿素,因此能在此培养基上生长。
3.从表中配方可以看出,配制选择培养基的原则是什么
提示 筛选菌株所用的选择培养基具有能满足所筛选微生物正常生长所需的营养物质或条件,同时不利于非筛选微生物的生长。
4. 要分离出分解纤维素的微生物,应在怎样的环境中取土样 该配制怎样的培养基
提示 应从富含纤维素的土壤中取土样,如树林中多年落叶形成的腐殖土。可以配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
5. 如何判断选择培养基是否具有筛选作用
提示 将待选择菌液同时接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行培养,观察同一稀释度的菌液接种的两种培养基上菌落的数目(其他条件相同且适宜),进行对比得出结论。
认知生成
选择培养基的三种培养方法
方法 特点 举例
一 利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养 控制培养基的营养成分,使营养缺陷型微生物不能正常生长 缺乏氮源的培养基可以用于分离_______微生物
二 利用某种化学物质进行的选择培养 在完全培养基中加入某些化学物质,利用加入的化学物质对微生物产生的影响，____________某些微生物的生长,从而选择所需的微生物 加入青霉素的培养基可以用于筛选酵母菌和霉菌
三 利用培养条件进行的选择培养 改变微生物的培养条件 将培养基放在高温环境中培养可以得到　 　 的微生物
固氮
抑制
耐高温
例1 分离土壤中分解尿素的细菌,对培养基的要求是( ) 。
C
A.①③⑤⑦
B.②④⑥⑧
C.①③⑤⑧
D.①④⑥⑦
①加尿素　②不加尿素　③加琼脂　④不加琼脂　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸盐　⑧不加硝酸盐
　　　　　　　　　　　　　　　　　　
[解析] 要分离土壤中分解尿素的细菌,培养基中尿素应是唯一的氮源,不能加硝酸盐;在固体培养基上形成菌落,要加琼脂作凝固剂;分解尿素的细菌是异养生物,要加有机碳源(如葡萄糖)。综上所述,C符合题意。
对点练1 （2022·扬州期中）通过选择培养基可从混杂的微生物群体中分离出所需的微
生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长;在培养基中加入青霉素可抑制细
菌和放线菌的生长;在培养基中加入10%的酚可抑制细菌和霉菌的生长;在不含碳源的培
养基上许多微生物无法生长。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出
( ) 。
①大肠杆菌　②霉菌　③放线菌　④固氮细菌　⑤自养微生物
A
A.④②③⑤
B.⑤④①②
C.④③⑤②
D.⑤①②③
[解析] 固氮细菌利用的氮源是氮气,在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长,而④固氮细菌可以生长,因此缺乏氮源的培养基可用于分离出④固氮细菌;霉菌是真菌,在培养基中加入青霉素后,青霉素可以抑制细菌(如大肠杆菌、固氮细菌)和放线菌的生长,而不可以抑制真菌的生长,因此加入青霉素的培养基可用于分离②霉菌;培养基中加入10%的酚可以抑制细菌(如大肠杆菌、固氮细菌)和霉菌的生长,可以分离出③放线菌;自养型生物能制造有机物,不含碳源的培养基可分离出⑤自养微生物。综上所述,A符合题意。
选择培养基上生长的微生物不一定都是目的菌。原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长,但实际上有些微生物可以利用其他微生物的代谢物生长繁殖,因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是目的菌,还需要进一步鉴定。
活动2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
下图是土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的流程示意图,请根据该流程进行实验,并结合教材提供的资料,分析下列问题:
1.测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量,选用的稀释范围相同吗 为什么
提示 不同。因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量少。
提示 第一次实验时可以将1×103~1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上。为了确保能从中选出菌落数为30~300的平板进行计数。
2.第一次实验可以选择用多大稀释倍数的稀释液进行涂布 第一次实验时为什么要将稀释范围放宽一些
3.在稀释涂布平板法中,为何需至少涂布3个平板 为什么一般选择菌落数为30~300的平板进行计数
4. 为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果
提示 尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值,因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。
提示 ①作为重复实验,统计时取平均值,以减少偶然因素对实验结果的影响,增强实验
结果的说服力。②若平板上菌落数过多,说明稀释度过低,菌体的密度大,就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落,结果不准确,且计数较困难。若平板上菌落数过
少,菌落形成的偶然性大,结果也不准确。
5. 稀释涂布平板法和显微镜直接计数法对微生物计数产生的实验误差如何 试分析原
因。
提示 稀释涂布平板法计数的值比实际值小,原因是当两个或多个细胞连在一起时,平
板上观察到的只是一个菌落;显微计数法计数的结果比实际值大,原因是显微镜下无
法区分细胞的死活,计数结果一般是活菌数和死菌数的总和。
认知生成
限制酶拓展
1.稀释涂布平板法的操作要求:按照平行重复的原则,每一稀释度的菌液涂布 　 　 平板。
2.计数的时机:当各平板上菌落数目　 　时进行计数。
3.选择可用于计数的平板:选择菌落数为　 的平板进行计数,然后取平均值。
4.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
3个或3个以上
稳定
30~300
提醒:为了确定培养基的灭菌是否合格,微生物实验一般会设置　 　对照,即随机取若干个灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间,观察培养基上是否有菌落生成。
空白
例2 关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述,错误的是( ) 。
B
A.土壤中的细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶
B.培养基应以尿素为唯一氮源,该细菌与硝化细菌所利用的碳源是相同的
C.若将10 mL土样稀释106倍后,取0.1 mL该溶液进行重复的涂布实验,测得的菌落数分别为18、234、276,则该10 mL土样中分解尿素的细菌数为2.55×1010
D.与平板划线法相比,稀释涂布平板法形成单菌落的效果更好
[解析] 土壤中的细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶,脲酶将尿素分解成氨,A正确;从土壤中分离分解尿素的细菌实验使用的培养基应以尿素为唯一氮源,分解尿素的细菌为异养型生物,利用的是有机碳源,硝化细菌是自养型生物,以CO2为碳源,CO2为无机物,B错误;通常选择菌落数为30~300的实验组平板进行计数,若将10 mL土样稀释106倍后,取0.1 mL该溶液进行重复涂布实验,测得的菌落数分别为18、234、276,则该10 mL土样中分解尿素的细菌数为[(234+276)÷2]÷0.1×106×10=2.55×1010,C正确;由于稀释涂布平板法中能够不断调整稀释度,因此利用该方法更易获得单菌落,D正确。
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个　 　,来源于样品稀释液中的一个　 　,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数,再计算一定体积的样品中微生物的数量
两种微生物计数方法的比较
单菌落
活菌
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
公式 每克样品中的菌落数= 　(C :某稀释度下平板上生长的平均菌落数。V :涂布时所用的稀释液的体积。M :稀释倍数) 每毫升原液所含细菌数= _________________________________________
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 ____________________________ 　
结果 比实际值_________　　 比实际值__________　　
×M
每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
不能区分细胞死活
偏小
偏大
对点练2 （不定项）下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示
意图。据图分析,下列叙述错误的是( ) 。
BC
A.上述过程中采用了稀释涂布平板法
B.3号试管中的样品溶液稀释倍数为103倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个
D.该实验使用的平板和试管较多,最好在使用前做好标记
[解析] 据题图可知,图中的接种方法为稀释涂布平板法,A正确;锥形瓶中已经稀释了10倍,图中5支试管为梯度稀释,因此3号试管中的样品溶液稀释倍数为104倍,B错误;5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168+175+167)÷3×106÷0.1=1.7×109个,C错误;该实验使用的平板和试管较多,为了避免混淆,最好在使用前做好标记,D正确。
素能提升 选择培养基与鉴别培养基
项目 选择培养基 鉴别培养基
制备方法 培养基中加入某些化学物质 在基础培养基中加入某种特殊的化学物质
原理 依据某些微生物的特殊营养需求或它们对某些化学物质具有的抗性 加入的特殊的化学物质会与某种微生物的代谢物发生反应,产生明显的特征性变化
用途 将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来 将某种微生物与其他微生物区分开来
举例 用不加氮源的培养基分离出固氮微生物,用不加碳源的培养基分离出自养型微生物,在培养基中加入青霉素分离出酵母菌等真菌 伊红—亚甲蓝琼脂培养基可用于鉴别大肠杆菌(出现金属光泽的深紫色菌落);刚果红培养基可用于鉴别纤维素分解菌(纤维素被分解后出现透明圈)
在实际应用中,有时需要配制兼具选择作用和鉴别作用的培养基。例如,金黄色葡萄球菌可以耐高浓度的NaCl,且能利用甘露糖醇产酸,可以根据这些特点来设计培养基,选择并鉴别金黄色葡萄球菌:在培养基中加入浓度为7.5%的NaCl、甘露糖醇和酸碱指示剂,金黄色葡萄球菌能够在这种培养基中生长,如果观察到有些菌落周围培养基颜色发生变化,可以推测这些菌落是金黄色葡萄球菌,之后再进行进一步鉴定;在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中,如果在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂(常用的酸碱指示剂,pH低于6.6呈现黄色,pH为6.6~8.0显示橙色,pH高于8.4呈现红色),能分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成NH3,NH3使培养基的pH升高,使指示剂变红,可以初步鉴定尿素分解菌,这种培养基则是一种既有选择作用又有鉴别作用的培养基。
1.(改编)厨房中的厨余垃圾多为湿垃圾,湿垃圾处理的有效方法之一是用微生物对其进行
降解。回答下列问题:
(1)餐厨垃圾高温堆肥是垃圾分类处理的常用方式。研究人员拟筛选出耐盐、嗜热的油
脂降解菌用于餐厨垃圾高温堆肥,为此进行筛选目的菌实验。他们从餐厨垃圾处理厂取
土壤制成浸出液,接种至含有上述培养基的锥形瓶中,在50 ℃、160 r/min的条件下振荡
培养。振荡培养的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点)。上述操作
有利于筛选出目的菌,主要体现在　　　　　　　　　　　　　　　　　　等方面。
增大溶氧量、增大菌种与培养液的接触面积
增大了目的菌的数量,使目的菌成为优势菌种
[解析] 振荡培养既可以增大溶氧量,也可以增大菌种与培养液的接触面积。振荡培养可以增大目的菌的数量,且能使其成为优势菌种,减少其他杂菌的比例,有利于筛选出目的菌。
(2)振荡培养后,用__________________________将菌液接种到固体培养基上,进而挑选出
分解油脂能力强的菌株。餐厨垃圾中油脂成分复杂,为验证挑选出的某种菌株的应用前景,
在最佳条件下利用该菌株处理色拉油(食用植物油)、餐饮油(从餐饮废水中提取,含动物
脂、植物油等多种成分)等油脂,实验结果如图1所示。图中结果表明该菌株　　　　
(填“适合”或“不适合”)用于餐厨垃圾堆肥,依据是　
　　　　　　　　　　　　。
稀释涂布平板法或平板划线法
适合
该菌株能使色拉油和餐饮油中的油脂
含量下降
[解析] 稀释涂布平板法或平板划线法都可以将菌液接
种到固体培养基上;分析图1可知,该菌株能使色拉油和
餐饮油中的油脂含量下降,适合用于餐厨垃圾堆肥。
(3)科研人员为筛选高效降解淀粉的菌种应用于垃圾处理,进行了如图2所示的试验过程。
A.配制培养基后需进行灭菌处理,常用的灭菌方法是____________________________。
培养基中加入的碳源是______。据图2,菌落①与菌落②周围产生了透明圈,产生透明圈
的原因是___________________________________________________________。
B.对同一浓度的高效降解淀粉的菌种稀释液,分别用血细胞计数板计数和稀释涂布平板
法计数,若不存在实验失误操作,则前者的数量多于后者,其原因是__________________
____________________________________________________________________。
高压蒸汽灭菌法(温热灭菌法)
淀粉
淀粉遇碘液显蓝色,产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解,形成透明圈
前者中该菌是分散的,活菌和死菌一起计数;后者只计数活菌,且存在多个菌株形成一个菌落的情况
[解析] 培养基灭菌常用高压蒸汽灭菌法(湿热灭菌法)。本实验目的是筛选高效降解淀粉的菌种,为了抑制不能分解淀粉的菌种的繁殖,培养基中需加入淀粉作为唯一碳源。淀粉遇碘液显蓝色,产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解,因此会形成透明圈,图中菌落①与菌落②周围产生了透明圈,说明菌落①与菌落②能产生淀粉酶。对同一浓度的高效降解淀粉的菌种稀释液,分别用血细胞计数板计数和稀释涂布平板法计数,血细胞计数板计数是将该菌的活菌和死菌一起计数,而稀释涂布平板法可能存在多个菌株形成一个菌落的情况,只计数一个活菌,因此若不存在实验失误操作,前者的数量多于后者。
2.(2023·北京期末)研究发现,感染毛霉能诱导脐橙产生具有抗病活性的红色物质——CP
RE。为探究CPRE能否替代化学杀菌剂保护采收后的脐橙,科研人员进行了研究。
(1)据表1配方配制培养基,溶解后分装到锥形瓶中,用　　　　　　　　　　　法灭菌后
冷却至50 ℃左右倒平板。分别加入浓度为25、50、100、200 μg/mL的CPRE无菌溶液,
摇匀备用,以无菌水作为对照。本培养基的氮源是　　　　。
高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)
[解析] 可用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。培养基中的葡萄糖和马铃薯都可以为微生物提供碳源,马铃薯还可以提供氮源。
马铃薯
成分 含量
马铃薯 200g
葡萄糖 20g
琼脂 15~20g
蒸馏水 定容至1000mL
表1　马铃薯培养基配方
(2)将含不同浓度CPRE的培养基分别涂于载玻片上凝固后,接种20 μL指状青霉孢子悬浮
液,在适宜条件下培养一段时间后,用显微镜观察孢子萌发情况。各组萌发率的计算公式
为:视野内萌发孢子数/视野内孢子总数×100%。根据萌发率计算实验组的萌发抑制率,
计算公式为　　　　　　　　　　　　　　　　　　。统计结果表明,CPRE能抑制指
状青霉孢子萌发,且随浓度的增加抑制效果增强。
(对照组萌发率-实验组萌发率)/对照组萌发率
[解析] 各组萌发率的计算公式为视野内萌发孢子数/视野内孢子总数×100%,则根据萌发率计算实验组的萌发抑制率的公式为(对照组萌发率-实验组萌发率)÷对照组萌发率。
(3)将直径为0.5 cm的指状青霉菌饼反贴在含不同浓度CPRE的培养基上,每个培养皿贴3
块,适宜条件下培养,每24 h测量菌饼直径(单位:cm),计算平均值。结果见表2。　　　
CPRE可抑制指状青霉的生长,一定范围内随CPRE浓度的增加,抑制效果增强
[解析] 根据表2中的数据可知,与对照组相比,加入CPRE的培养基上菌饼直径变小,说明CPRE可抑制指状青霉的生长,一定范围内随CPRE浓度的增加抑制效果增强。
表2　
时间 浓度/(μg/mL)
0 25 50 100 200
第1天 1.10 0.80 0.70 0.51 0.51
第2天 1.90 1.30 0.70 0.68 0.51
第3天 2.20 1.70 0.90 0.68 0.52
实验结果说明 。
(4)为进一步研究CPRE抑制指状青霉的机理,研究者进行了如下检测。
①检测不同浓度CPRE处理,菌丝几丁质(真菌细胞壁的主要成分)含量和胞外AKP酶活性
,结果如图1和图2。　　　
CPRE使青霉菌
注:AKP酶(碱性磷酸酶)由细胞合成后分泌到细胞壁与细胞膜的间隙。
图1和图2的结果表明,CPRE改变了细胞壁的结构和功能,判断依据是
　　　　　　　　　　　　　　　　　 。
细胞壁中几丁质的含量下降;随CPRE浓度和时间的增加,胞外AKP酶活性升高
②取指状青霉菌丝用碘化丙啶(与DNA结合产生红色荧光的染料)进行染色。结果为
　 ,说明CPRE破坏了细胞膜的完整性。
对照组菌内无荧光,实验组菌内出现红色荧光,并随CRPE浓度增加荧光强度增强
[解析] ①据图可知,CPRE使青霉细胞壁中几丁质的含量下降;随CPRE浓度和时间的增加,胞外AKP酶活性升高,说明CPRE改变了细胞壁的结构和功能。②由于只有活细胞的细胞膜具有选择透过性,而对照组菌内无荧光,实验组菌内出现红色荧光,并随CRPE浓度增加荧光强度增强,则说明CPRE破坏了细胞膜的完整性。(5)略。
(5)请结合以上研究分析说明CPRE抵御指状青霉感染的作用机制,并阐述脐橙受到“伤害”时才会启动防御机制的意义:
　 。
CPRE破坏指状青霉细胞壁和细胞膜,从而抑制指状青霉
孢子的萌发和菌体的生长,减少了指状青霉的感染。受到“伤害”才启动防御机制,有利于物质和
能量的合理分配,避免浪费,利于植物的生长和繁殖
课堂小结
课堂小测
1.以尿素为唯一氮源的平板能分离出可以合成脲酶的微生物。( )
√
2.在用涂布器涂布平板时,为了操作方便可完全打开培养皿的皿盖。( )
×
3.可使用平板划线法统计活细菌总数。( )
4.统计菌落数目时,统计的菌落数就是活菌的实际数目。( )
5.血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定,也可用于细菌的数量测定。( )
×
6.接种后未长出菌落的培养基可直接丢弃。( )
×
×
×

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