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第2节　微生物的培养技术及应用
【学习目标】
1.通过配制培养基,了解配制培养基的基本步骤,以及培养基中各类营养物质的配比。(科学探究)
2.通过对培养皿和培养基进行灭菌,了解消毒和灭菌的原理及方法。(科学思维)
3.通过酵母菌的纯培养,理解并掌握微生物接种、分离和培养的基本原理和过程。(科学探究)
第1课时　微生物的基本培养技术
【自主预习】
一、培养基的配制
1.概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其　生长繁殖　的营养基质——培养基。
2.分类
培养基种类 划分标准 特点 用途
　液体　 培养基 　物理性质　 不加凝固剂 工业生产
固体培养基 加凝固剂,如　琼脂　 微生物分离、鉴定等
3.营养成分
(1)各种培养基的具体配方不同,但一般都含有　水、碳源、氮源和无机盐　等营养物质。
(2)培养基还需要满足微生物生长对pH、　特殊营养物质　以及O2的需求。
4.对培养基的特殊需求
(1)培养乳酸杆菌时,在培养基中添加　维生素　。
(2)培养霉菌时,将培养基调至　酸性　。
(3)培养细菌时,将培养基调至　中性或弱碱性　。
(4)培养厌氧微生物时,需要提供　无氧的条件　。
二、无菌技术
1.获得纯净的微生物培养物的关键是　防止杂菌污染　。
2.消毒与灭菌
(1)概念
①消毒:使用较为　温和　的物理、化学或生物等方法杀死物体　表面　或内部　一部分　微生物。
②灭菌:使用　强烈　的理化方法杀死物体内外　所有　的微生物,包括　芽孢和孢子　。
(2)类型与方法
连一连:将无菌技术类型、常用方法和适用对象用线连起来。
3.具体操作
(1)对操作的　空间　、操作者的衣着和手进行清洁和　消毒　。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行　灭菌　。
(3)为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在超净工作台上并在　酒精灯火焰　附近进行。
(4)实验操作时要避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
三、微生物的纯培养
1.培养物、纯培养物与纯培养的概念
项目 概念
培养物 接种于培养基内,在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
纯培养物 由　单一个体　繁殖所获得的微生物群体
纯培养 获得纯培养物的过程
2.过程
配制培养基→　灭菌　→倒平板→　接种　→分离→培养。
3.酵母菌的纯培养
纯培养的原理 由　单一个体　繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物,获得　纯培养物　的过程就是纯培养
纯培养方法 平板划线法　和稀释涂布平板法
纯培养过程 制备培养基 配制培养基　→灭菌→　倒平板
接种和分 离酵母菌 用　平板划线　法在固体培养基表面接种酵母菌,经数次划线后培养,可以分离得到单菌落
培养酵母菌 待菌液被　培养基　吸收,将接种后的平板和一个未接种的平板　倒置　,放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养　24~48　h
【合作探究】
任务1　配制培养基
活动1　制备牛肉膏蛋白胨培养基
不同微生物对营养物质的需求不同,配制的培养基可以用于培养、分离、鉴定、保存微生物。下表记录了牛肉膏蛋白胨培养基的配方。
组分 含量
牛肉膏 5.0 g
蛋白胨 10.0 g
NaCl 5.0 g
琼脂 15.0~20.0 g
蒸馏水 定容至1000 mL
1.该培养基中主要提供碳源和氮源的物质各是什么
提示　主要提供碳源的是牛肉膏,主要提供氮源的是蛋白胨。
2.该培养基是固体培养基,还是液体培养基
提示　固体培养基,因为该培养基中加入了凝固剂(琼脂)。
3.若需要培养其他微生物,也可用牛肉膏蛋白胨培养基吗
提示　不同种类的微生物代谢特点不同,对培养基中营养物质的需求也不同,因此培养不同的微生物,需要按其对营养物质的需求特点配制培养基。如:
(1)自养型微生物所需的营养物质主要是无机盐, 碳源可来自大气中的CO2,如光合细菌、硝化细菌;氮源可由含氮无机盐提供,如硝酸盐。
(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物,即碳源和氮源一般都由有机物提供, 部分异养型微生物(如根瘤菌)也可以利用无机氮源。
【归纳总结】
1.培养基的配制原则
(1)目的要明确:不同的微生物需求不同,根据培养目的进行配制。
(2)营养要协调:营养物质的浓度和比例要适宜。
(3)pH要适宜:为维持pH的相对恒定,可在培养基中加入缓冲剂,常用K2HPO4-KH2PO4。
2.培养基的成分及功能
营养物质 定义 作用 主要来源
碳源 能提供　碳元素　的物质 作为构成生物体细胞的物质和一些代谢产物,有些也是异养生物的能源物质 无机碳源: CO2、NaHCO3 等;有机碳源:　糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油、牛肉膏　等
氮源 能提供　氮元素　的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 无机氮源:　N2、NH3、铵盐　等; 有机氮源:　尿素、蛋白胨　等
生长因子 生长必不可少的　微量　有机物 是酶和核酸的组成成分 维生素、氨基酸、碱基　等
水 — 是良好的溶剂,参与化学反应 培养基、空气、代谢产物
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素,包括大量元素和微量元素 是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源、酶的激活剂等 无机化合物
例1　(2022·郑州期中)下表记录了某培养基的配方,下列叙述错误的是(　　)。
成分 NaNO3 K2HPO4 MgSO4·7H2O
含量 3 g 1 g 0.5 g
成分 (CH2O) 蒸馏水 青霉素
含量 30 g 定容至1000 mL 0.1万单位
A.根据物理性质划分,该培养基属于液体培养基
B.该培养基不能用于培养大肠杆菌
C.根据培养基的配方可知,该培养基培养的是异养型微生物
D.固体培养基中加入少量水即可形成液体培养基
【答案】　D
【解析】　该培养基的配方中没有凝固剂(如琼脂),根据物理性质划分,该培养基属于液体培养基,A正确;该培养基中含有青霉素,而大肠杆菌不能在含有青霉素的培养基中正常生长,故该培养基不能用于培养大肠杆菌,B正确;该培养基中的(CH2O)可作为有机碳源,因此其培养的微生物是异养型微生物,C正确;液体培养基中加入凝固剂(如琼脂)可形成固体培养基,固体培养基中去除凝固剂(如琼脂)才能制成液体培养基,D错误。
【知识拓展】　　　动物、微生物和绿色植物所需营养物质的比较
营养物质 动物 (异养型) 微生物 绿色植物(自养型)
异养型 自养型
碳源 糖类、脂肪、蛋白质等 糖类、醇、有机酸等 二氧化碳、碳酸盐等 二氧化碳、碳酸盐等
氮源 蛋白质或其降解产物等 蛋白质或其降解产物、有机氮化物、无机氮化物 无机氮化物 无机氮化物
能源 与有机碳源相同 与有机碳源相同 氧化无机物或利用光能 利用光能
对点练1　培养某种微生物的培养基配方见下表,以下说法正确的是(　　)。
成分 NH4NO3 KH2PO4 CaCl2 FeSO4 维生素 蒸馏水
含量 0.5 g 3.0 g 0.5 g 0.5 g 少许 定容至 1000 mL
A.该培养基中含有碳源、氮源、水和无机盐四类物质
B.该培养基可用来培养硝化细菌,不能用来培养酵母菌
C.该培养基在培养硝化细菌时,需要密封
D.若要用该培养基培养酵母菌,则需要加入葡萄糖作为氮源
【答案】　B
【解析】　分析题表可知,该培养基中不含有碳源,A错误;由于该培养基中不含有碳源,而酵母菌是异养生物,故该培养基不能用来培养酵母菌,但硝化细菌是自养生物,其可以利用空气中CO2来合成有机物,因此该培养基可用来培养硝化细菌,B正确;硝化细菌需要利用空气中的CO2来合成有机物,因此该培养基在培养硝化细菌时,不能密封,C错误;若要用该培养基培养酵母菌,则需要加入葡萄糖作为碳源,D错误。
任务2　无菌操作
活动2　明确消毒的原理和方法
在医院里,医生、病人及陪护人员对环境和食品安全的重视程度都很高。回答下面的问题:
1.一些需要保持生物活性的物体,如医护工作者的双手等应该使用何种无菌技术 为什么
提示　应使用消毒的方法。因为用灭菌的方法会杀死或破坏人的皮肤组织细胞。
2.消毒能否杀死所有的微生物
提示　不能。消毒只能杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。
素能提升　通过学习无菌技术,关注生活中的现象和人类健康
1.“无菌操作”与人们的生活休戚相关,无时无处不在。在日常生活、生产实践、自身健康防护中,分别有哪些“无菌操作”的例子
提示　在日常生活中,“无菌操作”的例子有被褥、鞋袜要常晒;肉制品储存时用盐腌等。在生产实践中,“无菌操作”的例子有家畜阉割后,要在其伤口处涂抹一些酒精或白酒;初冬杨树树干涂刷生石灰水等。在自身健康防护中,“无菌操作”的例子有打针时,注射部位要用酒精棉球擦拭;在皮肤伤口处涂抹一些碘酒等。
2.注射药液前,常用酒精擦拭注射部位,这是消毒还是灭菌 体积分数为70%和95%的酒精,哪种效果更好 为什么
提示　酒精擦拭属于消毒。酒精消毒时,体积分数为70%的酒精杀菌效果更好。因为酒精浓度过高会使菌体表面的蛋白质凝固形成一层保护膜,酒精分子不能渗入其中;酒精浓度过低,杀菌能力减弱。
活动3　明确灭菌的原理和方法
1.消毒与灭菌的区别是什么 在什么情况下进行消毒 什么情况下进行灭菌
提示　消毒是杀死物体表面或内部的一部分微生物;灭菌是杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子。显然,灭菌的条件更严苛,其效果也比消毒更好。但是有些情况下只能进行消毒,有时是因为需考虑操作对象的承受能力,如活体生物材料、操作者的手等;有时是因为需考虑实施的难度和性价比,如很难对一个房间甚至一个街道进行灭菌,也没有必要。在不用考虑以上问题且需要严格无菌的地方,都要进行灭菌,如未接种的培养基、盛放培养基的容器和接种用的器具等。
2.灭菌的原理是什么 选择灭菌方法时,要注意什么问题
提示　灭菌的原理是使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子。选择灭菌方法时,要注意操作对象是否耐高温,如培养基含大量有机物,不耐高温,所以选择温度相对低的湿热灭菌。
3.牢固树立“无菌”意识,实验中严格执行无菌操作。无菌技术的目的是什么
提示　防止实验室的培养物被其他微生物污染,避免操作者自身被微生物感染。
认知生成
灭菌和消毒的比较
灭菌和消毒的种类 主要方法 应用范围
湿热灭菌(高压蒸汽菌) 100 kPa、121 ℃、维持15~30 min 培养基　及多种器材、物品
干热灭菌 在干热灭菌箱内,160~170 ℃、维持1~2 h 玻璃器皿　(如吸管、培养皿等)、金属用具等耐高温的和需要保持干燥的物品
灼烧灭菌 在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 微生物的接种工具(如　涂布器、接种环、接种针　或其他金属用具);接种过程中,试管口或瓶口等容易被污染的部位
煮沸消毒 100 ℃煮沸5~6 min 家庭餐具等生活用品
巴氏消毒 63~65 ℃消毒30 min 或72~76 ℃处理15 s,或80~85 ℃处理10~15 s 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒 用紫外线照射30 min 接种室、接种箱或超净工作台
化学药物消毒 用　酒精　擦拭双手、用氯气消毒水源等 皮肤、伤口、动植物组织表面、空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等
例2　(不定项)生产、生活和科研实验中常用到无菌技术。下列相关叙述正确的是(　　)。
A.微生物的接种工具如接种环、接种针可直接用火焰灼烧灭菌
B.实验室中的玻璃涂布器、吸管、培养基等均可以用干热灭菌法处理
C.生活中用巴氏消毒法处理牛奶既可消毒,又基本不会破坏牛奶中的营养成分
D.湿热灭菌是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法
【答案】　ACD
【解析】　微生物的接种工具如接种环、接种针可直接用酒精灯的充分燃烧层灼烧,可以迅速、彻底地灭菌,A正确;实验室中能耐高温且需要保持干燥的物品可以用干热灭菌法处理,培养基需要用高压蒸汽灭菌法处理,B错误;生活中用巴氏消毒法处理牛奶既可消毒,又基本不会破坏牛奶中的营养成分,C正确。
【知识拓展】　　　选择实施无菌技术的原则
1.获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染,这是研究和应用微生物的前提,也是发酵工程的重要基础。
2.无菌技术可防止实验室的培养物被其他微生物污染,还能有效避免操作者自身被微生物感染。
3.既要考虑使用的效果,又要考虑无菌操作对象的承受能力。一般情况下,在实验操作过程中,对能灭菌的对象进行灭菌处理,如培养皿及用到的各种器具;对无法灭菌的对象则进行消毒处理,如实验操作者的衣物和手等。
4.与煮沸消毒法相比,巴氏消毒法的优点是在达到消毒目的的同时,营养物质流失更少。
对点练2　(2022·绍兴联考)在微生物培养实验中,分别采用了高压蒸汽灭菌、酒精擦拭、火焰灼烧等几种不同的处理,这些方法依次可用于杀灭什么部位的杂菌 (　　)。
A.接种环、手、培养基
B.培养容器、手、微生物菌种
C.培养基、手、接种环
D.培养容器、微生物菌种、接种环
【答案】　C
【解析】　高压蒸汽灭菌法常用于培养基的灭菌;用酒精擦拭双手是消毒的一种方法;火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌,适用于微生物的接种工具,如接种针、接种环等金属用具,C符合题意。
任务3　微生物的纯培养
活动4　微生物的纯培养
结合下图,回答下列关于微生物的纯培养的问题:
1.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰
提示　对瓶口进行灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。
2.为什么等待培养基冷却凝固后,将培养皿倒置
提示　培养基冷却凝固后,皿盖上会凝结水珠。将平板倒置,既可以防止皿盖上的水珠落入培养基,又可以避免培养基中的水分过快挥发。
3.采用平板划线法接种菌种时,哪些操作可防止杂菌污染
提示　①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。②接种环蘸取菌液前后,要将试管口通过火焰。③划线时将培养皿打开一条缝隙,将蘸有菌种的接种环迅速伸入平板内,划线后及时盖上皿盖。④每次划线结束后,灼烧接种环,冷却后再进行下一次划线。⑤整个接种过程要在酒精灯火焰旁进行。
4.在第二次以及其后的划线操作时,为什么总是从上一次划线的末端开始划线
提示　划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次划线从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
5.接种操作时,每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针,其目的分别是什么
提示　第一次划线接种前灼烧接种环或接种针是为了避免接种环或接种针上可能存在的微生物污染培养物,之后的每次划线前灼烧接种环或接种针是为了杀死上一次划线结束后接种环或接种针上残留的菌种。划线结束后灼烧,能及时杀死接种环或接种针上残留的菌种,避免污染环境和感染操作者。
6.接种结束后,为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养 未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长,说明了什么
提示　培养未接种培养基的作用是对照,未接种的培养基在恒温箱中保温1~2 d后无菌落生长,说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成,说明培养基灭菌不彻底,或培养基被污染了,需要重新制备。
认知生成
倒平板操作的注意事项
1.培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。原因是琼脂是一种多糖,在98 ℃以上会熔化,在44 ℃以下会凝固,倒平板时高于50 ℃会烫手,低于50 ℃时,若不及时操作,琼脂会凝固。
2.倒平板时,要　使锥形瓶的瓶口通过火焰　。通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。
3.培养基冷却凝固后,要　将培养皿倒置　。
4.在倒平板的过程中,若不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,则这个平板　不能　用来培养微生物,因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
例3　(2022·临沂调研)下图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤,下列相关叙述正确的是(　　)。
A.步骤①操作时,倒好平板后应立即将其倒置
B.步骤②中将接种环在火焰上灼烧后迅速蘸取菌液进行平板划线
C.步骤④中的平板经恒温培养箱培养后可用来对X细菌进行计数
D.步骤③中多次划线,使接种物逐渐稀释,培养后出现单个菌落
【答案】　D
【解析】　步骤①操作时,倒好平板后应待培养基凝固后再将其倒置,A错误;步骤②中将接种环在火焰上灼烧,待接种环冷却后再放入试管中,蘸取菌液,否则会杀死菌种,B错误;步骤④中的平板是利用平板划线法接种获得的平板,不能用于计数,C错误;步骤③中多次划线,使接种物逐渐稀释,培养后在最后一次划线的区域出现单个菌落,D正确。
对点练3　(不定项)下图为微生物平板划线示意图,划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是(　　)。
A.在每一区域内划线时接种环上的菌种直接来源于菌液
B.划线操作时应在酒精灯火焰旁边揭开皿盖,划线接种
C.每次划线只能从上一次划线的末端开始,才能确保菌种被逐步稀释以得到单菌落
D.第1区和第5区的划线不能相连,以便分离出单菌落
【答案】　CD
【解析】　在第1区内划线时接种环上的菌种直接来源于菌液,而在其他区域内划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端,A错误;划线时在火焰附近将培养皿打开一条缝隙,而不是揭开皿盖,将接种环伸入平板内,迅速划三至五条平行线,盖上皿盖,B错误;从第二次划线操作起,每次总是要从上一次划线的末端开始划线,由于线条末端的菌体数量少,划线数次后,最终可得到由单个细菌繁殖而形成的菌落,故每次划线只能从上一次划线的末端开始,才能确保菌种被逐步稀释以得到单菌落,C正确;为得到单菌落,第1区和第5区的划线不能连接起来,D正确。
素能提升　联系生活实际,考查简单的设计运用能力
1.(2023·湖北模拟)网络上流行一种自制酸奶的方法,具体操作为:(1)牛奶倒入玻璃杯,放在沸水中加热10分钟;(2)降温到42 ℃,每杯牛奶加入0.15 g酸奶发酵剂;(3)用干净小勺搅拌均匀,在杯子外封上保鲜膜;(4)在42 ℃下保温5小时后,放在4 ℃冰箱中冷藏1小时。下列叙述不正确的是(　　)。
A.牛奶在沸水中加热10分钟,属于消毒的方式
B.第(2)步降温到42 ℃的目的是避免高温使菌种失活
C.每杯牛奶加入0.15 g酸奶发酵剂的目的是迅速使乳酸菌成为优势种
D.第(3)步封上保鲜膜的目的是保温
【答案】　D
【解析】　牛奶在沸水中加热10分钟,并不能保证可以杀死所有微生物及芽孢和孢子,故属于消毒的方式,A正确;第(2)步降温到42 ℃的目的是避免高温使菌种失活,B正确;每杯牛奶加入0.15 g酸奶发酵剂,酸奶发酵剂中含有乳酸菌,能迅速使乳酸菌成为优势种,C正确;第(3)步封上保鲜膜的目的不是保温,而是避免杂菌掉落,同时创造无氧环境,D不正确。
2.(2023·周口模拟)利用微生物对厨余垃圾进行处理,可变废为宝。某研究小组为了筛选出适合利用厨余垃圾发酵的乳酸菌,利用自然发酵完全腐熟的厨余垃圾有机肥进行了相关实验,将获取的有机肥样品加入已灭菌的MRS液体培养基中进行菌种选择培养,再利用MRS固体培养基进行分离纯化。在实验中使用了溴甲酚紫酸碱指示剂,当培养基pH由5.2升至6.8时,试剂颜色由浅黄色变成紫红色。请回答下列相关问题:
(1)从组成成分角度分析,MRS液体培养基与固体培养基的配方中通常都含有　　　　　　　　　　　　等营养物质,二者最大的区别是后者含有　　　　　　　　。对培养基进行灭菌常采用的方法是　　　　　　　　。在培养乳酸菌时,还要提供　　　　的气体环境条件。
(2)若用稀释涂布平板法将菌种接种到含溴甲酚紫的培养基上进行初步鉴定,则乳酸菌菌落周围的培养基颜色应为　　　　色。使用平板划线法分离菌种,在MRS固体培养基上进行划线操作时共划了6个区域,则该操作需要灼烧　　　次接种环。在观察时发现第一区域有菌落生长,而第二区域无菌落生长,若是操作问题导致的,则原因可能是　 　(答出两点)。
【答案】　(1)水、碳源、氮源和无机盐　凝固剂(如琼脂)　高压蒸汽灭菌(或湿热灭菌)　无氧　(2)浅黄　7　接种环灼烧后未冷却直接进行划线;未从上一次划线末端开始划线
【解析】　(1)培养基的配方中通常含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质,固体培养基中含有凝固剂,常用的凝固剂是琼脂。对培养基进行灭菌的常用方法是湿热灭菌法(或高压蒸汽灭菌法)。乳酸菌属于厌氧菌,因此培养乳酸菌要提供无氧条件。(2)若将菌种接种到含溴甲酚紫的培养基上,培养过程中乳酸含量增加会导致培养基pH降低而使溴甲酚紫酸碱指示剂呈浅黄色。使用平板划线法分离菌种,在MRS固体培养基上进行划线操作时共划了6个区域,在每次划线前后都要灼烧接种环,故该操作需要灼烧7次接种环。在观察时发现第一区域有菌落生长,而第二区域无菌落生长,若是由操作问题导致的,则原因可能是接种环灼烧后未冷却(烫死菌种)直接进行划线或未从上一次划线末端(没有菌种)开始划线。
【随堂检测】
课堂小结 课堂小测
1.液体培养基含有水,而固体培养基不含水。 (×) 2.用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行消毒。 (×) 3.配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH。 (√) 4.为纯化菌种,在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌,培养结果如图所示。 (1)倒平板后需间歇晃动,以保证表面平整。 (×) (2)图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多,应从Ⅲ区挑取单菌落。 (√)
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