资源简介

重组DNA技术的基本工具
【学习目标】
1.运用结构与功能观阐明基因工程的三种工具的作用。(生命观念)
2.关注基因工程的诞生和发展历程,参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。(社会责任)
3.探究DNA的物理与化学性质, 进行DNA分子的粗提取与鉴定。(科学探究)
【自主预习】
一、基因工程的概念
别称 重组DNA技术
原理 　基因重组　
操作环境 　生物体外　
操作水平 　DNA分子　水平
技术手段 转基因等技术
目的 赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的　生物类型和生物产品　
优点 克服远缘杂交不亲和的障碍,　定向　改造生物的遗传特性
二、重组DNA技术的基本工具
1.限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源:主要是从　原核生物　中分离纯化出来的。
(2)种类:分离的酶有　数千　种。
(3)作用:能够识别双链DNA分子的　特定核苷酸序列　,并且使每一条链中特定部位的　磷酸二酯键　断开。
(4)结果:产生黏性末端或　平末　端。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)种类
比较 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 　大肠杆菌　 　T4噬菌体　
特点 只能连接　黏性末端　 既可以连接黏性末端,又可以连接　平末端　
(2)作用结果:将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的　磷酸二酯键　。
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)作用:将外源基因送入受体细胞。
(2)常用种类:质粒、噬菌体、　动植物病毒　等。
(3)质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的　环状双链DNA　分子。
(4)作为载体的质粒需具备的条件:
a.质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点,供　外源DNA片段(基因)插入　其中。
b.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后,能在细胞中进行自我复制,或整合到　受体DNA　上,随受体DNA同步复制。
c.质粒DNA分子上有特殊的标记基因,便于　重组DNA分子的筛选　。
d.对受体细胞无害。
三、DNA的粗提取与鉴定
1.提取DNA的思路:利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在　物理和化学性质　方面的差异,提取DNA,去除其他成分。
2.提取DNA的原理
(1)DNA不溶于酒精,而某些　蛋白质　可溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
3.鉴定DNA的原理
在沸水浴的条件下,DNA与　二苯胺　试剂反应呈现蓝色。
4.方法步骤(以洋葱为例)
【合作探究】
任务1　探讨重组DNA技术所需要的两种工具酶
活动1　探究限制性内切核酸酶——“分子手术刀”的种类和作用
　　已知几种限制酶的识别序列如图所示,分析回答:
1.请写出以上几种限制酶切割DNA分子后形成的黏性末端,并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同 不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同
提示　BamH Ⅰ:—G—CCTAG,EcoRⅠ:—G—CTTAA,
Hind Ⅲ:—A—TTCGA,Bgl Ⅱ:—A—TCTAG。
同种限制酶切割产生的黏性末端相同,不同的限制酶切割也有可能形成相同的黏性末端。
2.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么
提示　限制酶是原核生物的一种防御工具,用来切割侵入细胞的外源DNA,以保证自身安全。
3.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
提示　含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列,或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开。
4.限制酶的识别和切割是否说明了酶的专一性
提示　虽然不同酶识别的碱基序列不同,切割位点也不同,但均是在特定位点切割DNA的,仍说明限制酶具有专一性。
认知生成
限制酶拓展
1.判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法:将其中一个末端旋转180°,若与另一个完全相同,则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。
2.特点:①只能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列;②只能在特定的部位进行切割;③主要切割外源DNA,而对自身的DNA不起作用,达到保护自身的目的。
3.在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶在目的基因的两侧切割此DNA分子,使目的基因的两端都有可连接的末端,切割的结果是同时产生四个黏性末端或平末端。
4.实质:使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
例1　(2022·日照期中)限制酶和DNA连接酶是重组DNA技术常用的工具酶。限制酶通常将DNA分子切割成带有黏性末端或平末端的DNA片段,而DNA连接酶可缝合带有黏性末端或平末端的DNA片段。据图分析错误的是(　　)。
A.图示三种黏性末端分别由不同的限制酶切割产生
B.甲与乙的黏性末端相同可形成重组DNA分子,甲与丙不能
C.DNA连接酶的作用位点是a处,能催化磷酸二酯键的形成
D.催化甲形成的限制酶能识别由甲、乙形成的重组DNA分子
【答案】　D
【解析】　切割产生甲的限制酶的识别序列为GAATTC//CTTAAG,切割产生乙的限制酶的识别序列为CAATTG//GTTAAC,切割产生丙的限制酶的识别序列为CTTAAG//GAATTC,由此可见,甲、乙、丙的黏性末端是由三种限制酶切割产生的,A正确;甲、乙的黏性末端相同,因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子,但甲、丙的黏性末端不同,它们之间不能形成重组DNA分子,B正确;DNA连接酶能催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键,C正确;切割甲的限制酶的识别序列为GAATTC//CTTAAG,而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为 GAATTG//CTTAAC,因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子,D错误。
易错辨析
1.限制酶是一类酶而不是一种酶。
2.限制酶作用于磷酸二酯键,而不是氢键。
3.不同种类的限制酶识别的序列与切割的位点不同,这与酶的专一性是一致的。
4.限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成,少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成;后者是双链核苷酸序列。
5.限制性内切核酸酶可用于切割DNA以获取目的基因,也可用于切割载体。
6.两个末端若是由同一种限制酶切割产生的,则两片段连接后还具有该种限制酶的识别序列和切割位点。
对点练1　(2022·常德质检)下表为几种限制酶的切割位点,相关叙述不正确的是(　　)。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ
识别序列及切割位点 ↓ 　　 GGATCC CCTAGG 　　　↑ ↓ 　　 TGATCA ACTAGT 　　　↑ ↓ 　 　 GATC CTAG 　 　　↑
A.限制酶能够水解DNA上特定的磷酸二酯键
B.BamH Ⅰ切割的序列一定能被Sau3A Ⅰ切割
C.Bcl Ⅰ切割的序列一定能被Sau3A Ⅰ切割
D.以上信息说明限制酶没有专一性
【答案】　D
【解析】　限制酶能够水解DNA上特定的磷酸二酯键,形成黏性末端或平末端,A正确;Sau3AⅠ识别的序列为 ↓
　GATC,BamHⅠ识别的序列为↓
GGATCC,后者识别的序列包含前者,
因此BamHⅠ切割的序列一定能被Sau3AⅠ切割,B正确;BclⅠ识别序列包含Sau3AⅠ的识别序列,因此Bcl Ⅰ切割的序列一定能被Sau3AⅠ切割,C正确;一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列后进行切割,以上信息说明限制酶有专一性,D不正确。
对点练2　(2023·烟台期中)下表表示常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点。下列说法错误的是(　　)。
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BglⅡ A↓GATCT KpnⅠ CCTAC↓C
EcoRⅠ G↓AATTC MboⅠ ↓GATC
HindⅠ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
注:Y=C或T,R=A或C。
A.限制酶的作用底物都是双链DNA分子,都能切开磷酸二酯键
B.BglⅡ和MboⅠ两种限制酶切割DNA分子后可形成相同的黏性末端
C.SmaⅠ切割DNA分子后形成的末端可用E.coli DNA连接酶连接
D.一种限制酶可能识别多种核苷酸序列
【答案】　C
【解析】　限制酶能识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂,A正确;BglⅡ和MboⅠ两种限制酶切割DNA分子后可形成相同的黏性末端,均为GATC—,B正确;SmaⅠ切割DNA分子后形成的末端为平末端,而E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端,C错误;HindⅠ限制酶的识别序列为GTY↓RAC,其中Y=C或T,R=A或G,说明其识别序列不止一种,则一种限制酶可能识别多种核苷酸序列,D正确。
活动2　探究DNA连接酶——“分子缝合针”的种类和作用
1.常用的DNA连接酶主要有哪两类
提示　一类是从大肠杆菌中分离得到的,称为E.coli DNA连接酶;另一类是从T4噬菌体中分离得到的,称为T4 DNA连接酶。
2.DNA连接酶的作用是什么
提示　能将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
3.以GAATTC碱基序列为例,尝试用图解的形式表示DNA连接酶与限制酶之间的关系。
提示　
限制酶是断裂磷酸二酯键,DNA连接酶是连接磷酸二酯键,二者作用部位相同,作用效果相反。
4.(1)若两个相同黏性末端都是由同种限制酶(如EcoRⅠ)切割后所得,　能　(填“能”或“不能”)再被所用的限制酶识别(如图)。
(2)若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得,　不能　(填“能”或“不能”)再被所用的限制酶识别(如图)。
例2　(2023·商丘联考)DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述错误的是(　　)。
A.T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端,也可以连接双链DNA片段的平末端
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段,重新形成磷酸二酯键
D.化学本质是蛋白质,可被蛋白酶破坏
【答案】　B
【解析】　T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端,也可以连接双链DNA片段的平末端,但连接平末端的效率低,A正确;DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端,形成磷酸二酯键,DNA连接酶连接的是两个DNA片段,B错误;用同种限制酶切开的两条DNA片段具有相同的黏性末端或平末端,DNA连接酶可将二者连接,重新形成磷酸二酯键,C正确;DNA连接酶的化学本质是蛋白质,可被蛋白酶水解失去活性,D正确。
知识拓展　　基因工程中用到的酶
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA分子切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
耐高温的DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链RNA末端
对点练3　(2022·台州期中)下图表示DNA分子的某一片段,其中①②③分别表示某种酶的作用部位,则相应的酶依次是(　　)。
A.DNA连接酶、限制性内切核酸酶、解旋酶
B.限制性内切核酸酶、解旋酶、DNA连接酶
C.解旋酶、限制性内切核酸酶、DNA连接酶
D.限制性内切核酸酶、DNA连接酶、解旋酶
【答案】　C
【解析】　①处为氢键,是解旋酶的作用部位;②处为磷酸二酯键,是限制性内切核酸酶的作用部位;③处为两个DNA片段的缺口,是DNA连接酶的作用部位。综上所述,C符合题意。
任务2　探讨基因工程操作的载体——“分子运输车”需要具备的条件
活动3　了解载体,探讨载体需要具备的条件
下图是质粒结构模式图,回答下列问题:
1.载体的作用是什么
提示　(1)作为运载工具,将外源基因转入受体细胞。(2)携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后,能在受体细胞内进行自我复制。
2.常见载体的种类和用途分别是什么
提示　
种类 用途
质粒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
噬菌体
植物病毒 将外源基因导入植物细胞
动物病毒 将外源基因导入动物细胞
3.质粒上氨苄青霉素抗性基因的作用是什么
提示　作为标记基因,便于重组DNA分子的筛选。
4.为使外源基因插入质粒中,质粒需具备的条件是什么
提示　有一个或多个限制性内切核酸酶的切割位点。
5. 细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同
提示　①化学本质不同:细胞膜上的载体的化学成分是蛋白质;基因工程中的载体有质粒(DNA)、噬菌体、动植物病毒等。②功能不同:细胞膜上的载体的功能是协助细胞膜控制物质进出细胞;基因工程中的载体的功能是把外源基因导入受体细胞。
6.天然的质粒可以直接用作基因工程载体吗 为什么
提示　不能。载体需具备以下条件:能在受体细胞中稳定存在并自我复制;有一个至多个限制酶切割位点;具有标记基因;对受体细胞无害。
例3　(2022·长沙检测)下列关于质粒的说法,不正确的是(　　)。
A.质粒存在于细菌和酵母菌等生物的细胞中
B.质粒DNA分子中每个磷酸基团都连着两个脱氧核糖
C.不同的质粒DNA,(A+G)/(T+C)的值一定相同
D.质粒是基因工程中常用的工具酶
【答案】　D
【解析】　质粒是环状DNA分子,故其分子中每个磷酸基团都连着两个脱氧核糖,B正确;因质粒是双链DNA分子,根据碱基互补配对关系A=T、G=C可知,不同的质粒DNA中,(A+G)/(T+C)的值一定相同,均为1,C正确;质粒是基因工程中常用的工具(载体),而非工具酶(工具酶是限制酶和DNA连接酶),D不正确。
对点练4　限制酶MunⅠ和EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—↓CTTAAG—和—↓GAATTC—。下图表示四种质粒和目的基因,其中,质粒上箭头所指部位为酶的识别位点,阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是(　　)。
A B
C D
【答案】　A
【解析】　用限制酶MunⅠ切割A质粒后,不会破坏标记基因,而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端,适于作为目的基因的载体,A符合题意;B质粒没有标记基因,不适于作为目的基因的载体,B不符合题意;C质粒含有标记基因,但用限制酶Mun Ⅰ切割后,标记基因会被破坏,因此不适于作为目的基因的载体,C不符合题意;D质粒含有标记基因,但用限制酶EcoRⅠ切割后,标记基因会被破坏,因此不适于作为目的基因的载体,D不符合题意。
素能提升　标记基因的筛选原理
基因工程操作过程中,载体上的标记基因通常是某些抗生素的抗性基因,便于重组DNA的筛选。下图表示标记基因的筛选原理。
1.目的基因要转入的受体细胞能不能有抵抗相关抗生素的能力,为什么
提示　不能,如果受体细胞具有抗性,那么所有的细胞都具有抵抗相关抗生素的能力,起不到筛选的作用。
2.含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞后,受体细胞如何对该抗生素产生抗性
提示　含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞后,将会在受体细胞中表达,使受体细胞对该抗生素产生抗性。
3.筛选时受体细胞应该在什么样的培养基中培养
提示　放在加入该抗生素的培养基中培养。
4.在筛选培养基上,怎样的细胞能够存活
提示　能够生存的是具有抗性基因的受体细胞,即导入了带标记基因的载体的受体细胞。
例4　(2023·咸阳月考)下图是4种不同质粒的示意图,其中ori为复制必需的序列,amp为氨苄青霉素抗性基因,tet为四环素抗性基因,箭头表示同一种限制酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是(　　)。
A.基因amp和tet是一对等位基因,常作为基因工程中的标记基因
B.质粒包括细菌细胞中能自我复制的小型环状DNA和病毒中的DNA
C.限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的氢键
D.用质粒4将目的基因导入大肠杆菌,该菌不能在含四环素的培养基上生长
【答案】　D
【解析】　等位基因是指同源染色体相同位置控制相对性状的基因,图示质粒无染色体结构,且amp和tet在同一个DNA分子上,不是一对等位基因,A错误;质粒指原核细胞或酵母菌细胞中能自我复制的小型环状DNA,动植物病毒的DNA不属于质粒,B错误;限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,C错误;重组质粒4中,氨苄青霉素抗性基因完好,四环素抗性基因被破坏,因此用质粒4将目的基因导入大肠杆菌,该菌不能在含四环素的培养基上生长,D正确。
任务3　探讨DNA的粗提取与鉴定的原理
活动4　通过实验操作,探讨DNA的粗提取与鉴定的原理
1.动植物细胞是否都可以作为实验材料 若使用动物细胞作为实验材料,使用鸡血而不用猪血的原因是什么
提示　都可以。猪的成熟红细胞没有细胞核,不易提取到DNA。
2.实验过程中要充分搅拌和研磨,如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响
提示　研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少,导致看不到丝状沉淀物,用二苯胺鉴定时颜色反应不明显。
3.提取过程中使用纱布过滤而不用滤纸过滤的目的是什么
提示　DNA会吸附在滤纸上,使用纱布过滤而不用滤纸过滤的目的是减少DNA的损失。
4.用冷却的酒精析出DNA的过程中,应如何使用玻璃棒搅拌 这样操作的目的是什么 玻璃棒上缠绕的白色丝状物的主要成分是什么
提示　沿一个方向轻轻搅拌,玻璃棒不要触及烧杯壁和烧杯底。目的是防止破坏DNA。白色丝状物的主要成分是DNA。
5.鉴定DNA的实验思路是怎样的
提示　鉴定DNA时,一支试管为对照组,另一支试管为实验组。两支试管中都先加入2 mol/L的NaCl溶液;在实验组试管中加DNA丝状物,对照组不加;加入二苯胺试剂后沸水浴加热。待试管冷却后,可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色,对照组无色。如果实验组蓝色较浅,说明提取出的DNA量太少。
认知生成
根据DNA的溶解性判断DNA的去向
1.DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解,过滤后要保留滤液。
2.DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中析出,过滤后要保留黏稠物,舍弃滤液。
3.DNA在加入体积分数为95%的预冷的酒精溶液中析出,用玻璃棒卷起丝状物即可,不用过滤。
例5　(2022·盐城期中)关于DNA的粗提取与鉴定实验的各步骤操作目的的表述,错误的是(　　)。
A.离心沉淀的血细胞中加水是为了使血细胞破裂从而提取DNA
B.加入物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液,是为了溶解DNA
C.向溶解有DNA的NaCl溶液中加蒸馏水是为了洗涤DNA,除去杂质
D.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
【答案】　C
【解析】　离心沉淀的血细胞中加水是为了使血细胞破裂释放DNA,从而提取DNA,A正确;NaCl溶液的物质的量浓度为2 mol/L时,DNA溶解,B正确;向溶解DNA的NaCl溶液中加蒸馏水是为了降低NaCl溶液的浓度,从而使DNA析出,C错误;在一定温度(沸水浴)下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,D正确。
知识拓展
1.加入研磨液后,必须充分研磨,否则细胞核不会充分破碎,释放出的DNA的量就会减少。
2.粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质等。
3.析出DNA时必须用“冷酒精”。预冷的酒精具有以下优点:①可抑制核酸水解酶的活性,进而抑制DNA降解;②抑制分子运动,使DNA易形成沉淀析出;③低温有利于增加DNA分子的柔韧性,减少其断裂。
4.实验中出现的丝状物的主要成分是DNA,实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的,应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌,避免破坏DNA。
5.为减少DNA的损失,一般使用纱布进行过滤。
对点练5　(2023·佛山期中)某同学用洋葱进行“DNA粗提取和鉴定”实验,操作错误的是(　　)。
A.添加洗涤剂后研磨,研磨要轻缓、柔和,防止产生大量的泡沫
B.用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的DNA
C.加入酒精后用玻璃棒沿一个方向搅拌,防止破坏DNA
D.加入二苯胺试剂摇匀后置于酒精灯火焰上加热
【答案】　D
【解析】　加入洗涤剂后研磨,动作要轻缓、柔和,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤的操作,A正确;利用蛋白酶分解杂质(蛋白质),从而使提取的DNA与蛋白质分开,起到纯化的作用,B正确;加入酒精后用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,C正确;在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,故加入二苯胺摇匀后要在沸水浴条件下鉴定,不能置于酒精灯火焰上加热,D错误。
【随堂精练】
课堂小结 课堂小测
1.限制酶也可以识别和切割RNA。 (×) 2.DNA连接酶能将碱基间的氢键连接起来。 (×) 3.E.coli DNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。 (×) 4.载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等,其中动植物病毒必须是DNA病毒。 (√) 5.将DNA丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中,加入二苯胺试剂即呈现蓝色。 (×) 提示　用二苯胺试剂鉴定DNA,需在沸水浴条件下进行。
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