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(共43张PPT)
第3章 基因工程
第2节　基因工程的基本操作程序
1.结合实例,采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。(科学思维)
2.运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。(生命观念)
3.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。(科学探究)
1.目的基因:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,主要是 的基因。
2.筛选合适的目的基因:较为有效的方法是从相关的已知 的基因中进行筛选。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR原理: 原理。
一、目的基因的筛选与获取
结构和功能清晰
编码蛋白质
DNA半保留复制
(2)PCR的基本条件
a.场所:在 中进行,其中一般要添加Mg2+。
b.模板:DNA双链。
c.原料:4种 。
d.酶: 。
e.引物:使DNA聚合酶能够从引物的 开始连接脱氧核苷酸。
　缓冲液　
　脱氧核苷酸　
　耐高温的DNA聚合酶　
3'端
(3)扩增过程
90 ℃　
单链
50 ℃
引物
72 ℃
DNA聚合酶
(4)结果:每一次循环后,目的基因的量可以增加一倍,即呈 形式扩增(约为2n,n为扩
增循环的次数)。
(5)鉴定:常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
指数
二、基因表达载体的构建
1.构建目的:使目的基因在受体细胞中稳定
存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的基
因能够 。
2.组成:除目的基因、标记基因外,它还必须
有 、终止子等。
3.构建过程:用同种限制酶或
的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载
体,再利用 将目的基因片段拼接
到载体的切口处,形成一个重组DNA分子。
　表达和发挥作用　
　启动子　
能产生相同末端　　
　　DNA连接酶　　
生物类型 导入方法 受体细胞 注意事项
植物 我国独创的 ;农杆菌转化法 受精卵或体细胞 农杆菌转化法一般适用于 和　
　
动物 　　 　 —
微生物 　 处理法 原核细胞 常用　　
三、 将目的基因导入受体细胞
1. 转化的概念:指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内 的过
程。
2.填表
维持稳定和表达
花粉管通道法
双子叶植物
裸子植物
Ca2+
显微注射法
受精卵
大肠杆菌
(1)农杆菌的特点:在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物;含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的 (可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(2)农杆菌转化法的原理:将 插入Ti质粒的T-DNA中,通过农杆菌的转化作用,就可以使目的基因进入植物细胞。
　T-DNA　
目的基因
四、目的基因的检测与鉴定
1.个体水平检测
(1)检测内容:是否有抗性以及抗性的程度;基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同。
(2)检测方法:转基因生物的抗性接种实验,比较基因工程产品与天然产品的功能活性。
(3)结果显示:是否赋予了预期抗性或蛋白质活性。
2.分子水平检测
检测内容 检测方法
目的基因是否插到受体细胞的DNA上 通过PCR等技术检测(DNA和DNA之间)
目的基因是否转录出mRNA 通过PCR等技术检测(DNA和mRNA之间)
目的基因是否翻译成蛋白质 抗原—抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间)
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验基础
(1)PCR原理: 。
(2)电泳:DNA分子具有可解离的基团,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用
下,这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动,这个过程就是电泳。
(3)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
DNA的热变性
相反
2.PCR实验操作步骤
3.DNA的电泳鉴定:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为 的紫外灯下被检测出来。
微量移液器
离心管
底部
300 nm
任务1 探讨获取目的基因的方法
活动1 探讨PCR的原理和过程
根据PCR技术的过程,思考回答下列问题:
1. 什么是引物 DNA复制时为什么需要引物
2. PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗
提示 引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在 DNA扩增时,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3‘端延伸DNA链,因此 PCR过程中应加入两种引物。
提示 不需要,只要知道目的基因两端的部分核苷酸序列,以便根据这部分序列合成两种引物。
3. PCR过程中需要解旋酶吗 所需要的DNA聚合酶应具有什么特点
提示 PCR过程中,DNA双链解开是在高温下完成的,不需要解旋酶;由于PCR过程温度较高,因此需要耐高温的DNA聚合酶。
4. PCR过程中若模板DNA分子中G—C碱基对含量较多,则变性时间会怎样
提示 若模板DNA分子中G—C碱基对含量较多,则DNA分子中的氢键较多,破裂氢键需要能量增多,变性时间会延长。
5. 在利用PCR获取和扩增目的基因时,从第几轮循环才会产生完整的目的基因
提示 第3轮。
6. PCR反应的特点是DNA呈指数形式扩增。PCR的产物一般是通过什么方法来测定的
提示 琼脂糖凝胶电泳。
认知生成
生物体内DNA复制与PCR反应的比较
比较项目 体内DNA复制 PCR反应
解旋 在解旋酶作用下,细胞提供能量,部分DNA双链解开 90 ℃以上解旋,DNA双链全部解开,不需要解旋酶
酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链 在引物基础上,一条链连续合成;另一条链不连续合成,再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的3'端开始延伸,都是连续合成的
认知生成
比较项目 体内DNA复制 PCR反应
过程 边解旋,边复制 变性→复性→延伸
循环次数 受生物体自身控制 一般30次
产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段
相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物;都是半保留复制,严格遵循碱基互补配对原则
续表
例1 基因工程中,获取目的基因的方法有很多种,可以直接利用PCR选择性地扩增目的
基因。下列关于目的基因的扩增及电泳鉴定的叙述,正确的是(　　)。
A.变性:利用高温破坏氢键,将目的基因的两条链解开
B.复性:降低温度,使目的基因的DNA恢复双螺旋结构
C.延伸:在DNA聚合酶的作用下,将4种核苷酸加到引物的5'端
D.鉴定:DNA呈指数扩增,PCR产物不经染色可用紫外光检测
A
[解析] 变性:利用高温破坏氢键,将目的基因的两条链解开,为复制提供模板,A正确。复性:降低温度,使目的基因的DNA模板链与引物结合,为后续子链延伸做准备,B错误。延伸:在DNA聚合酶的作用下,将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端,完成子链的延伸过程,C错误。鉴定:DNA呈指数扩增,PCR产物经染色可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D错误。
对点练1 (2022·南阳期中)有关PCR,下列叙述不正确的是(　　)。
A.是聚合酶链式反应,是以DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术
B.在用PCR扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C.PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸
D.PCR一般经历三十多次循环,每次循环分为变性、复性、延伸
C
[解析] 聚合酶链式反应是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术,A正确;在用PCR扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似,B正确;PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行,需提供DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸及耐高温的DNA聚合酶等,C不正确;PCR一般经历三十多次循环,每次循环均分为变性、复性和延伸三个阶段,D正确。
素能提升 引物的设计(科学思维能力)
1.PCR过程中的引物的化学本质是什么
2.设计引物的依据是什么
3.引物与模板链之间怎么结合 子链如何延伸
提示 引物是一小段能与DNA模板链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,可以是DNA,也可以是RNA,用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
提示 通常是目的基因两端的核苷酸序列。
提示 引物的5'端与模板的3'端结合。子链从引物的5'端向3'端延伸。
4.PCR操作过程中的两种引物应该符合哪些要求
5. 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的5'端加上限制酶的酶切位点,两种引物上加入的酶切位点能否相同 为什么
提示 ①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对,否则会导致自身折叠;②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,否则会导致引物自连。
提示 两种引物上应加入不同的酶切位点,以保证目的基因与载体的正向连接。
6. 复性时的温度与引物密切相关,温度不宜过高也不宜过低,为什么
7. 若一个DNA分子在PCR过程中经过n轮循环,理论上需要消耗多少个引物 第n轮循环需要消耗多少个引物
提示 若复性温度过高,引物可能无法与模板链结合,在允许范围内选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合,增加获得目标扩增产物的概率。
提示 经过n轮循环,需要消耗的引物数为2n+1-2个,第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。
例2 (2022·天津月考)利用PCR扩增目的基因的过程中,子链延伸需要引物。有关引物设
计的说法错误的是(　　)。
A.两种引物之间不能有互补性
B.每种引物自身不应存在互补性
C.设计引物时需要知道目的基因的全部碱基序列
D.引物的长度关系到PCR的特异性
C
[解析] 两种引物之间不能有互补性,否则引物之间会配对形成双链DNA,降低引物与DNA模板的结合率,A正确;每种引物自身不应存在互补性,防止引物自身折叠形成双链DNA,B正确;用PCR扩增目的基因时不必知道基因的全部碱基序列,只需要知道一段已知目的基因两端的部分核苷酸序列,从而根据这段序列合成引物即可,C错误;引物的长度关系到PCR的特异性,引物中碱基越少,PCR的特异性越差,D正确。
对点练2 (2023·福州期末)RT-PCR是将RNA逆转录(RT)与cDNA的PCR相结合的技术,可
利用此技术获取目的基因,具体过程如图所示。以下说法错误的是(　　)。
A.设计扩增目的基因的引物时需已知一段目的
基因序列
B.G—C含量高的引物在与模板链结合时,需要
更高的温度
C.过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA
聚合酶和引物A等
D.过程Ⅱ对单链cDNA进行n次循环的扩增,理论
上需要2n-1个引物B
C
[解析] 引物是一小段能与目的基因互补配对的短单链核酸,设计扩增目的基因的引物时需已知一段目的基因序列,A正确。若复性温度过高,则会破坏引物与模板之间的碱基配
对;若复性温度过低,引物与模板之间的非特异性碱基配对增加,由于G—C之间有三个氢
键,A—T之间有两个氢键,所以G—C含量越高的引物,需要的复性温度越高,B正确。过程Ⅰ是逆转录过程,所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等,C错误。过程Ⅱ对单链
cDNA进行n次循环的扩增,根据DNA的半保留复制可知,理论上需要2n-1个引物B,D正确。
活动2 探讨将目的基因导入受体细胞的方法
欲按照人们的意愿通过基因工程获得需要的新的生物类型和生物产品,必须使目的基因进入受体细胞并在受体细胞内维持稳定和表达。植物的受精卵或体细胞、动物的受精卵、大肠杆菌或酵母菌都是基因工程中常用的受体细胞。受体细胞不同,采用的导入方法也不同。常见的方法有花粉管通道法、农杆菌转化法、显微注射法以及Ca2+处理法等。请思考回答下列问题:
任务2 探讨获取目的基因的方法
1.为了获得转基因生物,在将目的基因导入受体细胞的程序中,动物一般不用体细胞作为受体细胞,而是用受精卵作为受体细胞,植物的体细胞和受精卵都可作为受体细胞,为什么
2.目的基因为什么不能直接导入受体细胞而是需要使用载体
提示　与细胞的全能性有关,动物的体细胞较难表现出全能性,动植物的受精卵以及植物的体细胞表现出全能性相对容易些。
提示　游离的DNA分子进入细胞内,一般会直接被分解,即使可以进行转录、翻译,游离的DNA也无法随着细胞分裂进行复制,导致子代细胞不再含有目的基因。
3. 农杆菌侵染植物细胞后,能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上的物质是什么
4.请用文字和箭头的形式表示农杆菌转化法的一般步骤。
提示　Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)。
提示　目的基因插入Ti质粒的T-DNA中→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
5. 农杆菌转化法中有几次拼接和导入过程
6.花粉管通道法与农杆菌转化法相比有什么优点
提示　农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到
Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
提示　①操作简便;②直接将目的基因导入受精卵,无须经过组织培养即可获得植株。
7. 将目的基因导入动物细胞的受体细胞,除了受精卵外,还可以选择什么细胞
8.以大肠杆菌作为受体细胞时,一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,为什么
提示　还可以选择将目的基因导入胚胎干细胞,因为胚胎干细胞也能发育成动物个体。
提示　Ca2+处理可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入大肠杆菌细胞中。
例3 农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞采用最多的方法。下图为农杆菌转化法
示意图,请据图回答问题:
(1)Ti质粒多存在于细菌中,它是能自我复制的　 　　　　　　　。
(2)获取外源基因(目的基因)需要限制酶的参与,而目的基因在重组过程中需要　 　　　酶
的参与,并依据碱基　 　　　原则进行重组。
(3)Ti质粒原存在于　　　　　 　中,其上的T-DNA具有可转移到受体细胞并整合到受体细
胞的　　　　　上的特点,因此携带外源基因的DNA片段必须插入　　　　　 　部位。
(4)农杆菌转化法适于将目的基因导入　　　　　　和祼子植物,而不易于感染大多数
　　　　　　　。
(5)若将相关的目的基因导入动物细胞或微生物细胞,则常采用　　　　　　　和
　　　　　　　。
小型环状DNA分子
DNA连接
农杆菌细胞质
染色体DNA
T-DNA片段(内部)
双子叶植物　
单子叶植物
显微注射技术
Ca2+处理法
互补配对
[解析] 将目的基因导入受体细胞的方法多种多样,应根据受体细胞的类型和目的基因的特点分别采用相应的方法。农杆菌转化法适于将目的基因导入植物细胞,而显微注射技术和Ca2+处理法分别适于将目的基因导入动物细胞和微生物细胞。
1.在自然条件下,农杆菌主要侵染的是双子叶植物和裸
子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
2.由导入目的基因的受体细胞培育出完整的植株要用
到植物组织培养技术。
3.目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的
差别,如图所示。
(1)图中a细胞减数分裂时,细胞质是不均分的,子细胞
不一定含有目的基因。
(2)图中b会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达,原因是在进行细胞减数分裂时,
细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中,保证了亲子代遗传性状的稳定性。
对点练3 (2023·开封期中)构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。
下列受体细胞与常用导入方法对应错误的是(　　)。
D
选项 受体细胞 常用的导入方法
A 棉花细胞 花粉管通道法
B 小鼠细胞 显微注射法
C 南瓜细胞 农杆菌转化法
D 枯草芽孢杆菌 显微注射法
[解析] 将目的基因导入棉花细胞的方法是花粉管通道法,是我国科学家独创的方法,A正确;将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法,且通常选择动物的受精卵细胞,B正确;将目的基因导入南瓜细胞(植物细胞)的方法是农杆菌转化法,这是导入植物细胞最常用的方法,C正确;枯草芽孢杆菌属于微生物细胞,将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法(感受态细胞法),D错误。
课堂小结
课堂小测
1.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。( )
2.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。( )
3.基因工程操作的核心步骤是目的基因的获取。( )
4.基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。( )
5.为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞。( )
6.可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。( )
√
×
×
提示　基因工程操作的核心步骤是基因表达载体的构建
×
提示　启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
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