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第三章
基因工程
3.2 基因工程的基本操作程序
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉与普通棉花
提示：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
从社会中来
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
（1）定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
1.目的基因
一、第一步：目的基因的筛选与获取
思考：Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
一、第一步：目的基因的筛选与获取
1.目的基因
非编码区
非编码区
启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点
开始转录
编码区
（1）原核生物基因
终止子：终止转录
非编码区组成：编码区上游与编码区下游
功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达(如启动子、终止子）。
一、第一步：目的基因的筛选与获取
1.目的基因
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
加 工
mRNA前体
成熟mRNA
不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列
编码序列=外显子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
（2）真核生物基因
转 录
1.目的基因
一、第一步：目的基因的筛选与获取
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是_____的
编码区是间隔的、_____的
相同点
都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
（2）编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
连续
不连续
编码区
非编码
（1）非编码序列：
包括非编码区和内含子
【思考】
1.目的基因
一、第一步：目的基因的筛选与获取
（4）利用PCR技术扩增目的基因
（3）化学方法直接人工合成
（2）从基因文库中获取目的基因
（1）从生物组织中直接获取
①从供体细胞直接获取目的基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。
②鸟枪法的具体做法：用限制酶将供体细胞中的 DNA 切成许多片段，将这些片段分别构建表达载体，然后通过载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的 DNA （外源 DNA ）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫作扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的细胞分离出来，如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用该方法获得。
③用“鸟枪法”获取目的基因的缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
2.目的基因的获取方法
一、第一步：目的基因的筛选与获取
（2）从基因文库中获取目的基因
基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
②cDNA文库：某种生物基因组转录的全部 mRNA 经反转录产生的cDNA 片段与适当的载体连接后导入受体菌，这样包含着全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为cDNA文库。
③用DNA探针从基因文库中准确提取目的基因
根据目的基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。用这一探针探查基因文库中已经变性的DNA片段，如果有一个DNA 片段能和探针片段互补而结合成双链（分子杂交），这一片段即含有所需要的基因。
①基因文库的种类
基因组文库：包含一种生物的全部基因
部分基因文库：包含一种生物的一部分基因（如cDNA文库）
一、第一步：目的基因的筛选与获取
2.目的基因的获取方法
①建立基因组文库
某生物所有DNA
特定的限制酶
基因组所有基因
每个基因和载体结合重组DNA分子
导入受体菌
基因组文库
(2)从基因文库中直接获取
一、第一步：目的基因的筛选与获取
②建立cDNA基因文库
某种生物的成熟mRNA
单链DNA
双链DNA片段（cDNA）
导入受体菌中储存
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
与载体连接
(2)从基因文库中直接获取
一、第一步：目的基因的筛选与获取
DNA合成仪
①前提：基因比较小、核苷酸序列已知
②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
(3)人工合成
一、第一步：目的基因的筛选与获取
2.目的基因的获取方法
目的基因的mRNA
单链DNA (cDNA）
双链DNA
(即目的基因)
反转录
合成
反转录法：
根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
推测
推测
目的基因
化学合成
(3)人工合成
一、第一步：目的基因的筛选与获取
2.目的基因的获取方法
PCR由穆里斯等人（先入为主）于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
(4)利用PCR获取和扩增目的基因
历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献。钱嘉韵（中国台湾省，1976年）
2.目的基因的获取方法
一、第一步：目的基因的筛选与获取
全称：
原理：
操作环境：
目的：
优点：
①PCR的概念：
PCR扩增仪
复制
复制
复制
复制
复制
(4)利用PCR获取和扩增目的基因
2.目的基因的获取方法
一、第一步：目的基因的筛选与获取
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
3′
5′
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端，即子链的延伸方向是5 ′→3 ′。
由于DNA聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物（最初的已有链）。
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
(4)利用PCR获取和扩增目的基因
2.目的基因的获取方法
一、第一步：目的基因的筛选与获取
②DNA复制所需的基本条件:
{D7AC3CCA-C797-4891-BE02-D94E43425B78}参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（体外用耐高温的DNA聚合酶）
（体外用高温代替）
（2种）
(4)利用PCR获取和扩增目的基因
说明：PCR所用原料实为dNTP，dNTP和ATP类似可以通过基团转移为反应提供能量。
因此体系中不需要添加ATP。
2.目的基因的获取方法
一、第一步：目的基因的筛选与获取
dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？
如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。 ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。
一、第一步：目的基因的筛选与获取
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
2种引物
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
③PCR条件:
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
(4)利用PCR获取和扩增目的基因
2.目的基因的获取方法
一、第一步：目的基因的筛选与获取
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
④PCR反应过程
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
(4)利用PCR获取和扩增目的基因
一、第一步：目的基因的筛选与获取
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
④PCR反应过程
一、第一步：目的基因的筛选与获取
④PCR反应过程
(4)利用PCR获取和扩增目的基因
一、第一步：目的基因的筛选与获取
呈指数形式扩增（ n次扩增循环后，DNA数量约为2n）
⑤PCR结果：
①n代后，DNA分子有_____个 ②n代后，DNA链有_____条
③第____代出现完整的目的基因 ④n代后，含引物的DNA分子有____个
⑤n代后，共消耗_____个引物 ⑥第n代复制，消耗了______个引物
⑦n代后，完整的目的基因有_____个
2n
2n+1
3
2n
2n+1-2
2n
2n-2n
(4)利用PCR获取和扩增目的基因
一、第一步：目的基因的筛选与获取
⑥PCR产物检测
(4)利用PCR获取和扩增目的基因
一、第一步：目的基因的筛选与获取
Taq DNA聚合酶的应用
高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。
PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。
PCR和细胞内复制的不同点？
缓冲液需要为PCR反应提供的物质？
DNA模板，四种脱氧核苷酸，分别与两条模板链相结合的两种引物，Taq 酶。
关于PCR的几点说明：
一、第一步：目的基因的筛选与获取
思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。
原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
用PCR可以扩增mRNA吗？
不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。
单链RNA
逆转录酶
杂交双链
DNA链
RNA链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
PCR扩增
一、第一步：目的基因的筛选与获取

1、聚合酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术。PCR 过程一般经历下述若干次循环： 90 ℃以上使模板DNA 解聚为单链→ 50 ℃左右下复性（引物与DNA 模板链结合）→ 72 ℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR 反应过程的叙述中，不正确的是
A.变性过程中破坏的是DNA 分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B.复性过程中引物与DNA 模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
C.延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D.PCR 技术与细胞内DNA 复制相比，所需要酶的最适温度较高
C
练习
2、“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有
A.8个 B.6个 C.4个 D.2个
A
练习
3、利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。下列说法不正确的是
A.cDNA文库的构建需要用到逆转录酶
B.图中的菌落是通过稀释涂布平板法获得的
C.核酸分子杂交的原理是碱基互补配对
D.从该文库中可以筛选到胰高血糖素基因
D
4、下列属于PCR技术所需条件的是
①单链的核苷酸序列引物　 ②目的基因所在的DNA片段
③脱氧核苷酸　④核糖核苷酸　
⑤DNA连接酶　 ⑥DNA聚合酶　 ⑦限制酶
A.①②③⑤ B.①②③⑥
C.①②③⑤⑦ D.①②④⑤⑦
B
练习
5、若想获得以下已知序列的DNA片段，设计了一些PCR引物，应选用的PCR引物是______(从引物①②③④中选)
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物
①5′AACTATGCGCTCATGA3′
②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′
③5′AGAGGCTACGCATTGC3′
④5′TCATGAGCGCATAGTT3′
③①
练习
6、若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，若想获得未知序列，选用的PCR引物应是______
②④
练习
目的
基因工程的核心是基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。同时使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的组成
一个基因表达载体的组成，除了有目的基因外，还必须有启动子、终止子、标记基因等。
二、第二步：基因表达载体的构建
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
本质
位置
功能
补充：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻的碱基
mRNA上三个相邻的碱基
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号（编码氨基酸）
翻译的结束信号（不编码氨基酸）
二、第二步：基因表达载体的构建
（1）结合图示，概述基因表达载体构建的流程：
①用限制酶切割载体，使它出现一个切口；
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因的DNA片段；
③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子。
目的基因
重组DNA分子
目的基因
【思考】
二、第二步：基因表达载体的构建
（2）如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
？
目的基因——载体连接物、
载体——载体连接物、
目的基因——目的基因连接物。
【思考】
二、第二步：基因表达载体的构建
a
b
a
b
双酶切的优点:
A.防止质粒重新环化
B.防止目的基因自身环化
C.防止质粒与目的基因反向连接
二、第二步：基因表达载体的构建
（3）如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
【思考】
双酶切
7、下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是
C
A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建
B.基因表达载体的构建并不一定相同
C.图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位
D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
练习
1.转化
指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
2.转化的受体细胞
受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
B.在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
如
A.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
①花粉管通道法
我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法
转化的受体细胞
（1）将目的基因导入植物细胞
C.实例:将Bt基因导入棉花细胞
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
①花粉管通道法
（1）将目的基因导入植物细胞
转化的受体细胞
冠瘿瘤
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等。
②农杆菌转化法
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）将目的基因导入植物细胞
转化的受体细胞
为什么农杆菌容易感染双子叶植物？
科学研究发现，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成，单子叶植物通常没有。
②农杆菌转化法
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）将目的基因导入植物细胞
转化的受体细胞
构建表 达载体
含目的基因的重组Ti质粒
表现出新性状的植株
导入植物
细胞
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
目的基因
Ti质粒
T-DNA
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
过程：
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建
基因表达载体
转入
农杆菌
导入
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
表达
新性状
②农杆菌转化法
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）将目的基因导入植物细胞
转化的受体细胞
转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片________________，然后_____________，并_____________；
受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将_____直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
②农杆菌转化法
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）将目的基因导入植物细胞
转化的受体细胞
8、该过程经过____次拼接、____次导入？
(1)第一次拼接
___________________________
(2)第二次拼接
___________________________
___________________________
(3)第一次导入
___________________________
(4)第二次导入
___________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
Ti质粒
目的基因
构建
基因表达载体
转入
农杆菌
导入
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
表达
新性状
练习
(5)用农杆菌感染时，优先选择 （受伤的/完好的）叶片与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理由是 。
受伤的
叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌
(6)若要利用农杆菌转化法转化单子叶植物细胞，可采取添加 ，其目的是 。
(7)利用Ti质粒构建重组质粒的目的是： 。
酚类物质
吸引农杆菌移向受体细胞，有利于目的基因成功转化
将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上，利用其将目的基因导入受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上，使目的基因的遗传特性稳定维持和表达
练习
操作程序：
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
（2）将目的基因导入动物细胞--显微注射法
①体积大，易操作。
②全能性高，易培养成完整个体。
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植（移植到同期发情的母畜子宫内）
获得具有新性状的动物
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
转化的受体细胞
拓展：【其他方法】科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
如慢病毒载体、腺病毒载体等。
（2）将目的基因导入动物细胞
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
转化的受体细胞
①受体细胞：
微生物（常用大肠杆菌）
优点：
繁殖周期短
体积小易于培养操作
多为单细胞
遗传物质相对较少
②方法流程：
大肠杆菌
CaCl2
感受态细胞
溶于缓冲液中的重组DNA分子
转化
（3）将目的基因导入微生物细胞
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
转化的受体细胞
Ca2+（或 CaCl2 溶液）对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。
③实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
三、第三步：将目的基因导入受体细胞
（3）将目的基因导入微生物细胞
转化的受体细胞
成熟mRNA
相应酶去除内含子
转录
翻译
真核基因：编码区（外显子+内含子）
多肽链
前体mRNA
蛋白质
加工
如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？
一般不能产生原来的蛋白质
原因：
①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子；
②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）
提取
如果把真核基因导入原核细胞中表达，不考虑蛋白质加工的问题，如何产生与原来结构相同的蛋白质吗？
mRNA单链
逆转录酶
DNA
单链
DNA双链
酶
这种双链DNA是不含内含子的DNA，叫做cDNA
成熟mRNA
去除内含子
转录
真核基因：编码区（外显子+内含子）
前体mRNA
相应酶
把真核基因的cDNA导入到原核细胞中表达。（具体做法，如图）
9、下列关于目的基因导入受体细胞的方法中，不正确的是
A.我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉
B.用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
C.将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法
D.利用农杆菌转化法培育大多单子叶转基因植物
10、菊花是一种双子叶植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长，还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长。某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述错误的是
A.受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞
B.将目的基因GNA插入到Ti质粒的T?DNA上构建表达载体
C.菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞
D.应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
D
练习
A
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；
2.检测内容及方法:
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}类型
检测内容
方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
病原体接种实验等
1.目的:
四、第四步：目的基因的检测与鉴定
(1)首先取出转基因生物的基因组DNA；
检测目的基因:
(2)将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记，以此做探针；
(3)使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中。
基因探针:简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂），且顺序已知的，与目的基因互补核酸序列(DNA或RNA)。
15N
15N
变性
变性
DNA分子杂交
四、第四步：目的基因的检测与鉴定
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
检测蛋白质:
抗原和抗体杂交
四、第四步：目的基因的检测与鉴定
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}转基因生物
鉴定方法
成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
四、第四步：目的基因的检测与鉴定
个体生物学水平的鉴定具体方法举例
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
到社会中去
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
到社会中去
（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。
到社会中去
这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
到社会中去
11、目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定关键步骤的是
A.检测受体细胞是否有目的基因
B.检测受体细胞是否有致病基因
C.检测目的基因是否转录mRNA
D.检测目的基因是否翻译蛋白质
12、PCR在生物学实验中具有非常广泛的用途，下列不属于PCR的应用范畴的是
A.扩增和筛选目的基因
B.检测目的基因是否导入受体细胞
C.检测目的基因是否转录出mRNA
D.检测目的基因是否翻译出蛋白质
D
练习
D
13、科学家已能运用基因工程技术，让羊合成并由乳腺分泌抗体，相关叙述中正确的是
①该技术将导致定向变异；②DNA连接酶能把目的基因与载体黏性末端的碱基对连接起来；③将目的基因导入受体细胞时采用显微注射技术；
④受精卵是理想的受体。
A.①②④ B.①③④ C.②③④ D.①②③④
14、采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是
①将毒素蛋白注射到棉受精卵中；②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养；④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。
A.①② B.③④ C.②③ D.①④
B
B
练习
15、某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后,与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_________________________
(答出两点即可)。而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是
______________________________________；
能自我复制、具有标记基因
练习
二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长。
并且________________和_________________
的细胞也是不能区分的，其原因是：_______________________________________
_______________________________________；
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有__________的固体培养基．
含有质粒载体
含有重组质粒
二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。
15、某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后,与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
练习
四环素
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验原理
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够________________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理；
DNA半保留复制
探究·实践
？
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为_______的______下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
？
琼脂糖凝胶电泳
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
？
2.材料用具
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
？
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）
5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）
1μL
20μmol/L的引物Ⅰ
2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ
2.5μL
H2O
28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）
1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg）
5～10μL
总体积
50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
？
微量离心管
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
？
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
3.方法步骤
（1）DNA片段的扩增
①移液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
③反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序
变性
复性
延伸
预变性
94℃,5min
/
/
30次
94℃,30s
55℃,30s
72℃,1min
最后一次
94℃,1min
55℃,30s
72℃,1min
预变性：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
？
（2）DNA片段的电泳鉴定
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳
观察记录
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，（一般配制质量体积比0.8%～1.2%）。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Maker）
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相，并与核酸分子量标准参照物比较被扩增产物的大小
3.方法步骤
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
？
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
⑤在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑥PCR扩增不能随意加大试剂用量。复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合，因此一般在PCR实验中引物的投入量远大于产物量（但不能随意加大浓度）；
3.方法步骤
（3）注意
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
？
思考：
若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的哪一极？
负极
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
？
4.结果分析与评价
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
？
课堂小结
概念检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
拓展应用
1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。
例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
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