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第三章
基因工程
3.1 重组DNA技术的基本工具
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
讨论：DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 上进行设计和施工的，因此又叫作 。
转基因
新的生物类型
分子水平
重组DNA技术
基因重组
②操作水平：
⑤操作结果：
①操作原理：
DNA分子水平
获得新的生物类型和生物产品
③操作环境：
生物体外
④操作对象：
基因
⑥优点：
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状。
一、基因工程
⑦工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
剪切→拼接→导入→表达
⑧操作过程：
一、基因工程
基因工程的理论基础？
【问题1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
理论基础
1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)
2.都遵循碱基互补配对原则
3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
【问题2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
理论基础
1.基因是控制生物性状的结构与功能单位
2.遗传信息传递都遵循中心法则
3.生物界几乎共用一套遗传密码
一、基因工程
DNA的分子结构
5’
A
T
G
C
T
A
C
G
3’
5’
3’
CH2
H
OH
H
H
H
H
碱基
磷酸
5’
4’
3’
2’
1’
3',5'-磷酸二酯键
5’
3’
5’
3’
一、基因工程
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 。
1.来源：
2.种类：
主要来自原核生物
限制酶
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶
3.作用特点：
专一性
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位
一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
4.识别序列：
EcoR Ⅰ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
Sma Ⅰ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamH Ⅰ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
Taq Ⅰ
5’……T-C-G-A……3’
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
3’……A-G-C-T……5’
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
5.限制酶名字的由来：
限制酶的命名是根据细菌种类而定：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
以EcoRI为例:
E：Escherichia (属)
co：coli (种)
R：RY13 (品系)
I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；
SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
6.切割结果：
产生黏性末端或平末端
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
例：限制性EcoRI的识别序列和切点是－G↓AATCC－，补充完整切割过程图：
限制性SmaI的识别序列和切点是－GGG↓CCC－，补充完整切割过程图：
—G
—CTTAA
AATTC—
G—
—GAATTC—
—CTTAAG—
EcoRI
—GGG
—CCC
CCC—
GGG—
—GGGCCC—
—CCCGGG—
Sma I
黏性末端
平末端
两种末端的正确书写
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？
可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端
3.限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
思考:
4.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。
限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。
所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
5.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
思考:
1、下图表示限制酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制酶识别的碱基序列，及切割位点是
A.5'-CTTAAG-3'，切点在C和T之间
B.5'-CTTAAG-3'，切点在G和A之间
C.5'-GAATTC-3'，切点在G和A之间
D.5'-CTTAAC-3'，切点在C和T之间
C
练习
2、下面哪项不具有限制酶识别序列的特征
A.GAATTC B.GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C.CTGCAG D.CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
3、在DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在 DNA上定位，使其成为 DNA 分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶 HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个 4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA 分子上的限制位点数目是以下哪一组？
A.HindⅢ1个，BamHⅠ2 个
B.HindⅢ2个，BamHⅠ3个
C.HindⅢ2个，BamHⅠ1 个
D.HindⅢ和BamHⅠ各有2 个
A
练习
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
A
T
G
C
T
A
T
A
EcoR I
EcoR I
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
G
C
G
C
T
A
A
T
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
T
A
A
A
A
T
T
G
C
T
A
T
A
生物A基因片段
生物B基因片段
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
不同来源的DNA片段混合
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用：
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
注意：不是连接氢键
（氢键的形成不需要酶的催化）
2.种类：
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
（1）E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接黏性末端
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
（2）T4 DNA连接酶连接平末端，效率低
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶
作用部位
作用对象
作用结果
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
DNA片段
DNA
单个的脱氧
核苷酸
DNA
DNA
将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
切割双链DNA分子
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
你能用DNA连接酶将他们连接起来吗？
2和 3和 ；
1和 ；
4和 。
7
6
5
8
旋转180度
判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端可能是用同一种限制酶切割
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
4、限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是
A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以原核生物中的限制酶也能剪切自身的DNA
练习
B
5、下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是
A.同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B.限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA
C.限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同
D.限制酶只能从原核生物中提取
B
6、如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是
A.①②③④ B.①②④③
C.①④②③ D.①④③②
C
练习
C
A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙不能
C.DNA连接酶的作用位点是b处
D.切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段
7、下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是
练习
D
练习
7、据图所示，有关酶功能的叙述不正确的是
A.限制性内切核酸酶可以切断a处
B.DNA聚合酶可以连接a处
C.解旋酶可以使b处解开
D.DNA连接酶可以连接c处
8、表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析以下说法正确的是
限制酶 BamH Ⅰ EcoR Ⅰ Hind Ⅱ
识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC GTY↓RAC
限制酶 Kpn Ⅰ Sau3A Ⅰ Sma Ⅰ
识别序列和切割位点 GGTAC↓C ↓GATC CCC↓GGG
(注：Y表示C或T，R表示A或G)
D
A.一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列
B.限制酶的切割位点一定位于识别序列的内部
C.不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端
D.限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端
练习
2.种类：
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌
等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
1.作用：
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.最常用的载体——质粒
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
终止子：转录的终点，在转录过程中起调控作用。
启动子: 转录的起点，在转录过程中起调控作用。
复制原点:DNA复制的起始位点。
标记基因
其基因属于细胞质基因。
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
4.运载体需具备的条件：
①在受体细胞中稳定存在并能自我复制
或整合到受体DNA上，随受体DNA同
步复制；
②有一个至多个限制酶切割位点，
便于插入（携带）目的基因；
③具有标记基因，便于筛选含有
重组DNA分子的细胞；
④对受体细胞无害、易分离。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。
3.为什么不能直接将目的基因导入受体细胞？？
1.质粒上有一个或多个限制酶切点，有什么作用？
思考：
大肠杆菌及质粒结构模式图
供外源基因或外源DNA片段插入其中。
2.质粒上有标记基因，有什么作用？
便于重组DNA的筛选、鉴定和选择。
目的基因不能自主复制，不能稳定存在并遗传给后代。
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
学会归纳
细胞膜上的载体与基因工程中的载体比较
①细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞, 与细胞膜的选择透过性有关；
②基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
①细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；
②基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)；也可能是生物，如动植物病毒等。
化学本质不同
功能
不同
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
思考·讨论
？
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
重组DNA分子
思考·讨论
？
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
质粒的自身环化
由于用同种限制酶切割，会产生相同黏性末端，则可能导致目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。
限制酶的选择
1.酶切位点要保证目的基因是完整的
2.酶切位点要要位于启动子和终止子之间（启动子下游）
9、下列有关质粒的叙述中,正确的是
A.质粒是存在于细菌中的一种细胞器
B.质粒改造后可用作基因工程的载体
C.质粒上基因的表达不遵循中心法则
D.质粒必须具有抗生素抗性基因以便筛选
10、基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是
A.能够复制，以便目的基因插入其中
B.具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达
C.具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选
D.对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选
B
C
练习
11、用限制酶EcoRⅤ单独切割某质粒，可产生1个14 kb(1 kb即1 000个碱基对)的长链，而同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图(其中*表示EcoR Ⅴ切割后的一个黏性末端)。
若用MboⅠ单独切割该质粒，则产生的DNA片段的长度为
A.2.5 kb和5.5 kb B.2.5 kb和6 kb
C.5.5 kb和8 kb D.6 kb和8 kb
D
练习
12、选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中添加
抗生素B，则应该选择的限制酶
为_______。
（2）在培养细菌的培养基中添加
抗生素A，则应该选择的限制酶
为_____。
①或②
①
*酶③也会切割酶②识别的序列，因此不能选择酶③
练习
提取生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
五、DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA不溶于酒精，
但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，
DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
五、DNA的粗提取与鉴定
思考：
1.如何描述该变化曲线？
2.若DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高，如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；
在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；
当NaCl溶液浓度高于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐升高
先用2mol/L 的NaCl溶液溶解DNA，再加入蒸馏水，使其溶液浓度从2mol/L下降到0.14 mol/L，使DNA在盐溶液中析出
五、DNA的粗提取与鉴定
2.材料用具
（1）材料：
富含DNA的材料，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等、
研磨液、体积分数为95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
（2）用具：
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑;
选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
五、DNA的粗提取与鉴定
(3)试剂及作用：
研磨液：
体积分数为95%的冷酒精：
2mol/L 的NaCl 溶液：
蒸馏水：
二苯胺试剂：
析出DNA（即粗提取DNA）。
溶解DNA（并去除部分杂质蛋白）
滴入NaCl溶液中，使其浓度逐渐下降至0.14mol/L,从而析出DNA
破坏细胞，释放出细胞内的物质。
——鉴定DNA（要现配现用，用棕色瓶保存）
五、DNA的粗提取与鉴定
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
3.方法步骤
（1）通过研磨释放 DNA
称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
五、DNA的粗提取与鉴定
①研磨的目的：
②研磨时间不宜太长：
③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶：
④研磨不宜太用力
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
研磨效果好（有利于充分研磨）
（2）过滤获取含DNA的上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，
在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。
为减少 DNA 的损失，过滤过程一般使用纱布
可能含有核蛋白、多糖等杂质
低温放置几分钟的作用：
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
五、DNA的粗提取与鉴定
在上清液中加入体积相等的、预冷（作用同低温）的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min ，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的 DNA 。用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。
（3）冷却酒精析出DNA
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
五、DNA的粗提取与鉴定
（4）DNA的鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
五、DNA的粗提取与鉴定
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？
用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
结果分析与评价
五、DNA的粗提取与鉴定
2.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
实验结果不明显的可能原因：
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：
动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
五、DNA的粗提取与鉴定
结果分析与评价
思考：
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质
五、DNA的粗提取与鉴定
视频演示：DNA的粗提取与鉴定
五、DNA的粗提取与鉴定
进一步纯化DNA
方法一：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
方法二：可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
五、DNA的粗提取与鉴定
方法三：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
刑侦破案
拓展：DNA提取的应用
基因组测序
插入人胰岛素基因的大肠杆菌
基因工程
亲子鉴定
五、DNA的粗提取与鉴定
13、玉米的PEP（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，错误的是
A.该技术是在DNA水平上进行设计和施工的
B.该技术的操作环境是生物体内
C.该技术的原理是基因重组
D.该技术的优点是定向培育人类需要的生物类型
14、关于DNA粗提取和鉴定实验中，下列叙述错误的是
A.哺乳动物的红细胞不宜选作DNA提取材料
B.DNA可用二苯胺试剂鉴定，呈现蓝色
C.改变NaCl溶液的浓度只能使DNA溶解而不能使其析出
D.要用冷酒精沉淀DNA，甚至可将酒精与DNA溶液的混合液放入冰箱中冷却，以增加DNA提取量
B
练习
C
15、下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是
A.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
B.预冷的乙醇溶液可用来粗提取DNA
C.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
D.鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
16、将粗提取的DNA丝状物分别加入物质的量浓度为0.14
mol/LNaCl 溶液、物质的量浓度为2mo/LNaCl溶液、体积分数为95%的酒精溶液中，然后用放有纱布的漏斗过滤，分别得到滤液P、Q、R以及存留在纱布上的黏稠物p、q、 r,其中由于含DNA少可以丢弃的是
A.P、Q、R B.p、q、r C.P、q、R D.p、Q、r
D
C
练习
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用：把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D.用来识别特定基因的DNA探针
C
A
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
拓展应用
拓展应用
3.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe I进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、Xba I、EcoR V和Xho I进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
拓展应用
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
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