资源简介

(共32张PPT)
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和
施工的，因此又叫作重组DNA技术。
操作水平：
操作原理：
优点：
DNA分子水平
基因重组（广义）
克服远缘杂交不亲和的障碍
定向改造生物的遗传特性。
1. 不同生物的基因为什么能拼接？
2. 外源基因为什么能在受体细胞中表达？
（1）DNA是主要的遗传物质。
（2）遗传信息的传递都遵循中心法则。
（3）生物界共用一套遗传密码。相同的遗传信息在
不同的生物体内表达出相同的蛋白质。
基因工程诞生的理论基础
（1）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
（2）双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
（3）都遵循碱基互补配对原则。
重组DNA技术的基本工具
问题探讨
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶
DNA连接酶
载体
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
一. 限制性内切核酸酶 —— “分子手术刀”
限制性内切核酸酶：简称限制酶
1.来源：
2.种类：
主要从原核生物中分离纯化出来
迄今分离的限制酶有数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:____________________________。
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
资料卡-限制酶的命名：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。
练习：粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______；
SmaⅠ
EcoR Ⅰ
Sam Ⅰ
在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开
在它识别序列的中心轴线处切开
粘性末端
平末端
3、作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
几种常见的限制酶的识别序列及切割位点：
①大多数限制酶的识别序列由 个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
6
②一般都是回文序列：即正反读顺序相同，围绕一条轴线反向对称重复排列。
正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致
EcoRⅠ：
专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间的磷酸二酯键断开。
A. 形成的黏性末端（从5’往3’读）为________
B. 一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键形成___个黏性末端
C. 两个黏性末端有___个游离的磷酸基团，消耗 分子水
D. 同一种限制酶切割形成的黏性末端________
AATT
两
相同
2
黏性末端
切口带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对。
2
中轴线
平末端
Sma I：
专一识别CCCGGG的序列，并使G和C之间的磷酸二酯键断开。
切口，是平整的
要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性或平末端？
现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ ________
GATC
AATT
AGCT
GATC
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。
二. DNA链接酶 —— “分子缝合针”
1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
注意：氢键的形成不需要酶的催化
2.DNA连接酶的种类：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点
大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来；
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端；
恢复的都是磷酸二酯键
不能连接具有平末端的DNA片段。
又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）。
3.E·coli DNA连接酶连接黏性末端的作用
两个DNA片段要具有互补（相同的）黏性末端才能连接起来。
把两个DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来；，
DNA连接酶将两个双链DNA片段“缝合”连接起来，形成一个双链DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
T4 DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。
4.T4 DNA连接酶的缝合作用
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
几种与DNA有关的酶的比较
三. 基因进入受体细胞的载体 —— “分子运输车”
1. 作用：
将目的基因转入受体细胞。
2. 种类：
通常是用质粒，噬菌体、动植物病毒也可以。
目的基因插入位点
复制原点
氨苄青霉
素抗性基因
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
☆真核生物如酵母菌中也存在质粒。
3. 运载体需具备的条件：
有一个至多个限制酶切割位点
可自我复制
具有特殊的标记基因
对受体细胞无害、易分离
便于插入（携带）目的基因
使目的基因稳定存在且数量可扩增
便于鉴定和筛选
☆真正被用作载体的质粒，都是在天
然质粒的基础上进行过人工改造的。
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制原点
【核心探讨】标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
四. DNA的粗提取与鉴定
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
用EcoR I处理以下片段，横线标注出识别序列，箭头标注断键部位
1.判断哪一条链可能提供目的基因，哪一条链可能作为载体？
2.DNA上随意截下的DNA片段都能称得上一个基因吗？
不能；因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
一、提取生物大分子的基本思路：
实验设计思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
1.提取原理
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，
能溶于2mol/L NaCl溶液。
二、提取生物大分子的提取原理与鉴定原理
2.鉴定原理
在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
三、材料用具
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
1.选材：
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑；选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
三、材料用具
2.试剂：
①研磨液：
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA
四、方法步骤
取材、研磨
过滤或离心取上清液
预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
NaCl溶液溶解DNA并鉴定
四、方法步骤
1.取材、研磨：
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。
研磨的目的：
破碎细胞，使核物质溶解在研磨液中
充分研磨：
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量
四、方法步骤
2.过滤或离心取上清液：
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
（1）过滤能用滤纸代替吗？
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
（2）上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
（3）低温放置几分钟的作用：
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
四、方法步骤
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
（1）搅拌时应轻缓、并沿一个方向：
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
（2）酒精预冷的作用:同“低温放置的作用”
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
四、方法步骤
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
五、结果分析与评价
拓展探究：
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
以血液（如鸡血细胞）为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。

展开更多......

收起↑