资源简介

(共44张PPT)
基因工程发展历程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
选必三 P68-69
基因工程
就是按照人们的愿望（定向），通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
选必三 P67
操作对象
操作水平
操作原理
结果
优点
基因
DNA分子水平
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因重组
能克服远缘杂交不亲和的障碍；
定向改造生物的遗传特性。
思考-讨论
基因工程诞生的理论基础
1. 为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
（1）DNA的基本组成单位都是 。
（2）双链DNA分子的空间结构都是 。
2. 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
（1） 是控制生物性状的独立遗传单位。
（2）遗传信息的传递和表达都遵循 。
（3）生物界共用一套 。
四种脱氧核苷酸
规则的双螺旋结构
基因
中心法则
遗传密码
1’
2’
3’
4’
5’
脱氧核苷酸
聚合成
3’
5’
一条脱氧核苷酸链
3’，5’-磷酸二酯键
形成
两链之间：
A、T间形成2个氢键，C、G间形成3个氢键
A
C
T
G
DNA双链平面结构
--
--
--
--
--
第三章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
授课教师：XXX
WxW
选必三 P70
导入
扩增
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
非转基因番木瓜
转基因番木瓜
“工欲善其事，必先利其器”。在培育转基因番木瓜时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组DNA分子导入番木瓜体内，并使其表达。
DNA分子极小，实现这些精确操作需要哪些“分子工具”呢？
重组DNA技术的基本工具：
三、运载体——分子运输车
分子运输车
一、限制性内切核酸酶——分子手术刀
分子手术刀
二、DNA连接酶——分子缝合针
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
1. 来源：
主要从原核生物中分离纯化来的
数千种
2. 种类：
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
【P72资料卡】限制酶名字的由来
限制酶是如何命名的呢？是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个(拉丁文)字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如，一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR Ⅰ。
①粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcesens)中分离的第一种限制酶为_______；
②流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离出3种限制酶，则分别命名为：_______________________________。
Hind Ⅰ、Hind Ⅱ、 Hind Ⅲ
Sma Ⅰ
5'
3'
5'
3'
T
A
G
G
T
A
T
C
C
A
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列（特异性），并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
3. 作用：
“两个特定”
3’,5’-磷酸二酯键
形成________末端 或 _____末端
4. 切割结果：
黏性
平
1. 请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
（1）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能
（2）请结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水。
限制酶只能识别并切开双链DNA分子
2
2
2
2
随堂练习
限制酶所识别序列的特点是：
1. 都可以找到一条中心轴线
2. 中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列
在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
5. 限制酶的识别序列
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
倒转180°，完全相同则为同一种限制酶切割
1. 下列黏性末端最可能由同种限制酶切割而成的是( )
① ②
③ 　　　 　④
　　　　　　　　　　　　　　　　　　
A.①② B.①③ C.①④ D.②③
B
随堂练习
2. 请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。
3
①
②
③
随堂练习
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
6. 实例：
（1）EcoR I 限制酶
黏性末端
黏性末端
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的末端，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
识别特定序列为GAATTC；
切割特定部位为G、A之间的磷酸二酯键
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ ________
GATC
AATT
AGCT
GATC
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。
随堂练习
P75页 2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
（1）Xba Ⅰ。因为 Xba Ⅰ与 Spe Ⅰ切割产生了相同的黏性末端。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别 DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的 DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
中轴线
（2）Sma I 限制酶
在C和G之间切开
6. 实例：
识别特定序列为CCCGGG；
切割特定部位为C、G之间的磷酸二酯键
当限制酶在它的识别序列的中轴线处将DNA分子切开时，产生的末端的切口是平整的，这样的切口叫平末端。
平末端　　　平末端
（2）Sma I 限制酶
【P71旁栏思考题】你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
【P74拓展应用1】为什么限制酶不切割细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
【思考】1、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
供体生物细胞
取出DNA
限制酶
得到目的基因
2、如果把两种来源不同的DNA用同一种
限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端。
【思考】把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
1. 作用：
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
⑴ E·coli DNA连接酶
⑵ T4 DNA连接酶
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
2. 种类：
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
（1）E·coli DNA连接酶的缝合作用
CTTCATG
GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA
GGGATT
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
TCTTCATG
AGAAGTACTTAA
AATTCCCTAAG
GGGATTC
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
E·coli DNA连接酶在基因工程中的应用
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·coli DNA连接或T4DNA连接酶连接粘性末端
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
（2）T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低
E·coli DNA连接酶与T4DNA连接酶比较：
类型 来源 功能 相同点 不同点
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸
二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
【P72旁栏思考题】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
【P72旁栏思考题】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
1. 作用：
作为运输工具，与外源/目的基因的DNA片段结合，将外源基因送入受体细胞中。
2. 种类：
三、基因进入受体细胞的载体 —“分子运输车”
质粒
动植物病毒
噬菌体/细菌病毒
如：λ噬菌体的衍生物(一种经过人工改造的λ噬菌体,可用于基因工程的载体。它是一种温和噬菌体，遗传物质是DNA,专门侵染大肠杆菌。)
质粒
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
（1）能够在宿主细胞中稳定保存并复制、表达
（2）有一个至多个限制酶切点
（3）有某些标记基因
（4）对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。
能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；
便于鉴定和筛选含重组DNA的细胞
3. 载体需具备的条件：
三、基因进入受体细胞的载体 —“分子运输车”
最好有多种限制酶的单一切割点，可运载多种目的基因
氨苄[biàn]青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制原点
λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒作为运载体利用的原理是
.病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
物种（组织）特异
例：若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
霍乱弧菌中含有质粒，但 （填“能”、“不能”）用来做载体，因为选择的载体应该 。
对受体细胞无害
不能
除质粒外的其他运载体：
普通的细菌一般是对抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四环素的培养基中______（能/不能）生长。如果给普通细菌导入一个含有四环素抗性基因的质粒，四环素抗性基因的____________可使细菌获得抵抗四环素的性状。
敏感
不能
表达产物
【思考】如何利用标记基因的筛选呢？
标记基因通常有:
①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)
②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GCCGTATG…
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
选必三 P73
思考·讨论：重组DNA分子的模拟操作
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
GCCGTATG…
选必三 P73
思考·讨论：重组DNA分子的模拟操作
选必三 P73
思考·讨论：重组DNA分子的模拟操作
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对/bp以上。
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 噬菌体 、动植物病毒
小结
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
断开磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：形成/恢复磷酸二酯键
种类： E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
下图是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：
（1）用EcoR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段；
（2）用PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（3）同时用SmaⅠ 和PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（4）只用PstⅠ 酶切，最多能得到 种DNA片段。
2
3
5
5
完全酶切和不完全酶切
一、概念检测
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D．只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2．在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A．大肠杆菌的质粒 B．切割DNA分子的酶
C．DNA片段的黏性末端 D．用来识别特定基因的DNA探针
练习与应用 （书本P74-75）
C
A
随堂练习
关于下图所示黏性末端的叙述，正确的是
A.①与③是由相同限制酶切割产生的
B.DNA连接酶可催化①与③的连接
C.经酶切形成④需要脱去2分子水
D.DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端
B
1. 若某链状DNA分子中含有两个Hind Ⅲ的识别序列，该DNA分子将被切成几个片段，断裂几个磷酸二酯键？
3、4
2. 画出Spe Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后产生的末端图。
-A　　　　　CTAGT-
-TGATC　　　　　A-
　　Spe Ⅰ
-GAT　　ATC-
-CTA　　TAG-
　EcoR Ⅴ
随堂练习
下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图。据图回答下列问题。
(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同,都是　　　，
二者还具有其他共同点,如①　 　 　　　,②　　　　　　　 。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为-A
-TGCGC,
则与之连接的目的基因切割末端应为　　 　;可使用
________　　　把质粒和目的基因连接在一起。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为　 　　　，
其作用是　　　　　　　　　　　　　　。
(4)下列常在基因工程中用作载体的是　　　。
A.苏云金杆菌的抗虫基因　B.土壤农杆菌的环状RNA分子
C.大肠杆菌的质粒　 D.动物细胞的染色体
DNA
能够自我复制
具有遗传效应
CGCGT—
A—
DNA连接酶
标记基因
便于重组DNA分子的筛选
C

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