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3.1.1 DNA的粗提取与鉴定
授课教师：XXX
选必三 P74
选必三 P74
实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
(一)原理
1. 粗提取的原理：
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
（1）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
【资料】当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。
利用这一特点，
选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀；
或者让其他成分溶解，DNA析出
补充：(3)DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
①蛋白酶—水解蛋白质，对DNA没有影响。
②高温—大多数 在60～80℃时变性沉淀,而 在
80℃以上才会变性。
③洗涤剂—溶解细胞膜，
去除 ;
但对DNA没有影响。
蛋白质
DNA
脂质、蛋白质
1. DNA 粗提取的原理：
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实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
(一)原理
1. 粗提取的原理：
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
（1）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
2. 鉴定的原理：
在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此用二苯胺试剂鉴定DNA分子。
DNA
+
二苯胺
沸水浴
蓝色
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实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
(二)材料用具
1. 实验材料的选取：
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑。选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
2. 实验用具：
【思考】可以使用哺乳动物的成熟红细胞作为实验材料吗？
×
烧杯、量筒、玻璃棒、
研钵、纱布、漏斗、
试管、试管架、试管夹、
酒精灯、陶土网、三脚架、火柴、
刀片和天平等。
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实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
(二)材料用具
3. 试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
研磨液和二苯胺试剂的配制方法参见本书附录 2（P117）
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
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实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
(三)方法步骤：
取材、研磨
过滤或离心取上清液
预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
NaCl溶液溶解DNA并鉴定
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实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
(三)方法步骤：
1. 取材、研磨：
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨(可加入少量石英砂)。
研磨的目的：
破碎细胞壁，破坏细胞核，释放出DNA 。
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实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
(三)方法步骤：
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解。
2.过滤或离心取上清液：
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用：
纱布允许DNA通过，减少DNA损失。不能用滤纸！
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实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
(三)方法步骤：
3. 预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
搅拌时应轻缓、沿一个方向的原因：
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
→除去RNA、大部分核蛋白和多糖等。
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实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
(三)方法步骤：
4. NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
实验组
对照组
水浴加热
加入2mol/L NaCl溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
加入2mol/L NaCl溶液
加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
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实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
【思考】如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
【思考】冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用？
①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解。
②低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
③抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出。
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实践 探究：DNA的粗提取与鉴定
(四)结果分析与评价
1. 你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
补充除去滤液中的杂质(纯化的三个方案)：
方案一：原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同
【思考】为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质
用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；
用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。
因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
30mL滤液＋35gNaCl→同方向搅拌，DNA溶解→加入蒸馏水→调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L DNA析出 →过滤除去溶液中的杂质，得到过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解DNA →DNA-NaCl溶解液
方案二：30mL滤液＋嫩肉粉（木瓜蛋白酶）
→静置10～15分钟→DNA滤液
原理：利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，从而使DNA与蛋白质分开
方案三：30mL滤液→60～67℃处理→过滤
获得含DNA滤液
原理：DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
补充除去滤液中的杂质(纯化的三个方案)：
【思考讨论】方案二与方案三的原理有什么不同？
以鸡血为实验材料的实验设计（参考方案）：
1.向10ml鸡血细胞液（含柠檬酸钠，防凝血）中加入20ml蒸馏水，搅拌5min。
2.3～4层纱布过滤，取滤液。
3.加入2倍体积的2mol/lNaCl溶液，搅拌1min。
4.贴壁缓慢加入蒸馏水，直至粘稠物不再增加。
5. 3～4层纱布过滤，得DNA粘稠物。
6.用2mol/lNaCl溶液20ml溶解DNA粘稠物，搅拌3min
7. 3～4层纱布过滤，取滤液。 3-7步的目的：纯化DNA
8.贴壁缓慢加入40ml预冷的酒精，缓慢、均匀搅拌得丝状物，取出丝状物。
9.鉴定：用2mol/lNaCl溶液5ml溶解丝状物，再加二苯胺试剂4ml，水浴加热。
【思考】在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，若加入蒸馏水、洗涤剂和食盐，它们的作用分别是什么？
洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；
食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解或析出。
血细胞在蒸馏水中大量吸水涨破，搅拌加速细胞破裂；
随堂练习
（2021·山东·13）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA 相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )
A. 加入适量的木瓜蛋白酶 B. 37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟
C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精
D. 加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14mol/L
A
[详解]A、木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；
B、37~40℃的水浴箱中保温10~15分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温10~15分钟，使蛋白质变性析出，B错误；
C、向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；
D、加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14mol/L，DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。
随堂练习
（2021·天津·6）孟德尔说：“任何实验的价值和效用，取决于所使用材料对于实验目的的适合性。”下列实验材料选择不适合的是（ ）
A. 用洋葱鳞片叶表皮观察细胞的质壁分离和复原现象
B. 用洋葱根尖分生区观察细胞有丝分裂
C. 用洋葱鳞片叶提取和分离叶绿体中的色素
D. 用洋葱鳞片叶粗提取 DNA
（2022·北京·13）下列高中生物学实验中，对实验结果不要求精确定量的是（ ）
A. 探究光照强度对光合作用强度的影响
B. DNA 的粗提取与鉴定
C. 探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度
D. 模拟生物体维持 pH 的稳定
C
B
随堂练习
（2023·江苏·9）某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B. 洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，溶液即呈砖红色
C. 制作根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D. 粗提取的 DNA 溶于 2mol/L NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色
（2023·广东·11）“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A. 裂解：使细胞破裂释放出 DNA 等物质
B. 分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C. 沉淀：可反复多次以提高 DNA 的纯度
D. 鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
A
D

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