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第九章 生物化工反应单元工艺
9.1 微生物基础
9.2 酶学与酶工程
9.3 培养基与淀粉制糖工艺
9.4 培养基的灭菌和空气除菌
9.5 生物反应器
9.6 生物物质分离纯化
9.7 生化生产工艺实例简介
9.1 微生物基础
1.微生物的特点
1.1 什么是微生物？
微生物是指那些个体微小，结构简单，必须借助显微镜的帮助才能看清它们外形的一群微小生物，包括所有形体微小的单细胞(细菌、酵母等)，个体结构简单的多细胞(如霉菌等)，或没有细胞结构的低等生物(病毒或类病毒等)。
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1.2 微生物的共同特点
比表面积大，代谢能力强
若以人体的“面积和体积”比值为1，则与人等质量的大肠杆菌这一比值高达30万。
代谢能力强的主要原因是由于个体小，比表面积大，能够在细胞与环境之间迅速交换营养物质和代谢产物。
例如，发酵乳糖的细菌在1小时内可分解其自身质量1000~10 000倍的乳糖。
生物化工反应单元操作
——微生物基础
1.2 微生物的共同特点
（2）种类多，分布广
类型 低限 倾向种数 高限
病毒与立克次氏体 1 217 1 217 1 217
支原体 42 42 42
细菌与放线菌 >1 000 1 500 1 500
蓝细菌 1 227 1 500 1 500
藻类 15 051 23 100 23 100
真菌 37 175 47 300 68 939
原生动物 24 068 24 068 30 000
总数 79 780 98 727 127 298
地球上除了火山的中心区域外，从土壤圈、水圈、大气圈直至岩石圈，到处都有微生物家族的踪迹。
生物化工反应单元操作
——微生物基础
1.2 微生物的共同特点
（3）生长旺，繁殖快
在生物界中，微生物具有最高的繁殖速度，其中以二均分裂方式繁殖的细菌尤为突出。
在适宜的条件下，大肠杆菌能在20~30min繁殖一代，24h可繁殖72代。
微生物这一生长迅速、繁殖快的特性在发酵工业上具有重要的实际意义。
生物化工反应单元操作
——微生物基础
1.2 微生物的共同特点
（4）适应性强，易培养
微生物可通过自身的调节机制诱发某些特殊酶系的生成，以使其能适应该环境的特殊要求。
大多数微生物都能在常温常压下，利用简单的营养物质生长，并在生长过程中积累代谢产物，所以发酵工业上常利用各种微生物来生产各种产品。
生物化工反应单元操作
——微生物基础
1.2 微生物的共同特点
（5）易变异
微生物易变异原因：
个体多为单细胞或结构简单的多细胞，甚至非细胞结构，易受到外界物理或化学因素影响。
例如：
生产青霉素的产黄青霉菌, 开始筛选获得时，每毫升发酵液仅含约20单位的青霉素, 但经过多次诱变选育后，每毫升已超过5万单位，甚至接近10万单位。
生物化工反应单元操作
——微生物基础
2 常见的工业微生物
2.1 细菌
什么是细菌？
细菌是一类细胞细而短（细胞直径约0.5μm，长度约0.5~5μm）、结构简单、细胞壁坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物。
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——微生物基础
发酵工业常用的细菌
醋杆菌属(Acetobacter)
醋杆菌是产醋酸的主要菌种，有两种类型的鞭毛，一种是周生鞭毛细菌，可将乙醇氧化成醋酸，并将醋酸进一步氧化成CO2和H2O；另一种是极生鞭毛，也可将乙醇氧化成醋酸，但醋酸不能进一步被氧化。
氧化法制醋所用的醋杆菌有醋化醋杆菌(Acetobactor aceti)、巴氏醋杆菌(Acetobacter Pasteurianus)、许氏醋杆菌(Acetobacter schutzenbachui)等。
生物化工反应单元操作
——微生物基础
发酵工业常用的细菌
乳杆菌属(Lactobacillus)
革兰氏染色阳性
微好氧或厌氧
营养要求复杂，需要生长因子
葡萄糖
同型发酵
乳酸
异型发酵
乳酸
乙醇
德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbruekii)
工业乳酸
德氏乳杆菌保加利亚亚种
嗜酸乳杆菌
干酪乳杆菌
酸奶
干酪
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——微生物基础
发酵工业常用的细菌
芽孢杆菌属(Bacillus)
好氧或兼性厌氧
环境条件不利时会形成芽孢
枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一，生产淀粉酶、蛋白酶（纳豆激酶）、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。
苏云金芽子包杆菌(Bacillus thuringiensis)的伴孢晶体是一种广泛使用的生物农药，可用于生物杀虫剂。
生物化工反应单元操作
——微生物基础
发酵工业常用的细菌
梭菌属(Clostridium)
细胞杆状，可形成梭形孢子
以周毛运动或不运动
革兰氏阳性，少数为阴性或不定
专性厌氧菌
丙酮丁醇芽孢梭菌
工业生产丙酮丁醇
生物化工反应单元操作
——微生物基础
发酵工业常用的细菌
大肠杆菌(Escherichia coli)
革兰氏染色阴性，无孢子的杆菌，在动物肠
中行程细菌群，菌落呈白色至黄白色，光滑
应用：
大肠杆菌是进行微生物学、分子遗传学和基因工程很好的研究材
料。
大肠杆菌也是最早用作基因克隆的宿主菌。
工业上生产谷氨酸脱羧酶、治疗白血病的天冬酰氨酶和制备天冬
氨酸、苏氨酸及缬氨酸。
大肠杆菌也是食品业和饮用水卫生检验的指示菌。
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——微生物基础
发酵工业常用的细菌
产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)
短而直的杆菌
革兰氏阳性
大多数不运动（运动种具有周毛或极毛）无芽孢
产氨短杆菌
发酵生产氨基酸和核苷酸类产物
产氨短杆菌KY13105是工业上生产肌苷酸的主要菌种
产氨短杆菌IFQ12071是生产辅酶A的主要菌种
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——微生物基础
2.常见的工业微生物
2.2 放线菌
什么是放线菌？
放线菌是一类介于细菌和真菌之间的又接近细菌的丝状原核生物。
放线菌有发育良好的菌丝体，菌丝体分为基内菌丝和气生菌丝，但无横隔，为单细胞，菌丝和孢子内不具有完整的核，因此放线菌属于原核微生物。
放线菌以无性方式繁殖，主要是形成孢子，也可通过菌丝断片繁殖。
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——微生物基础
营养菌丝
气生菌丝
孢子丝
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——微生物基础
发酵工业常用的放线菌
放线菌对人类最突出的贡献就是它能产生大量的、种类繁多的抗生素达4400多种。
链霉菌属(Streptomyces)
抗生素主要由放线菌产生，而其中90%由链霉菌属产生。
形态：有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝（形成分生孢子）、无横隔 、多核 ，孢子丝为长链，呈直、波曲或螺旋状。
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——微生物基础
链霉菌的次生代谢产物：
链霉素、土霉素、红霉素
抗肿瘤的博莱霉素、丝裂霉素
抗真菌的制霉菌素
抗结核的卡那霉素
能有效防治水稻纹枯病的井冈霉素等
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——微生物基础
诺卡氏菌属(Nocardia)
只有营养菌丝
一般没有气生菌丝
能产生的抗生素：
小单孢菌属(Micromonospora oerskov)
有营养菌丝，无气生菌丝
营养菌丝上长出很多分枝小梗，顶端着生一个孢子
地中海诺卡氏菌
利福霉素
绛红小单孢菌和棘孢小单孢菌
庆大霉素
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——微生物基础
2.常见的工业微生物
2.3 霉菌
什么是霉菌？
霉菌亦称丝状真菌，是真菌的主要代表。凡生长在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的真菌，统称为霉菌。
霉菌的菌落形态较大，质地一般比放线菌疏松，外观干燥不透明，呈或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基连接紧密，不易挑取，菌落的正反面颜色以及边缘与中心的颜色常不一致等。
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——微生物基础
霉菌的繁殖有无性繁殖和有性繁殖两种方式。无性繁殖主要是产生孢囊孢子、分生孢子、厚壁孢子和节孢子；有性繁殖通过产生有性孢子而进行。
霉菌在自然界分布极广，同人类的生产、生活关系密切。
在发酵工业、农业、纺织、食品和皮革等方面也起着极重要的作用。
风味食品、酒精、抗生素（青霉素、灰黄霉素）、
有机酸（柠檬酸、葡萄糖酸、延胡索酸等）、
酶制剂（淀粉酶、果胶酶、纤维素酶）、维生素、甾体激素等。
在农业上用于饲料发酵、植物生长刺激素（赤霉素）、
杀虫农药（白僵菌剂）等。
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——微生物基础
霉菌也有对人类不利的一面，有的霉菌能造成农副产品、衣物、木材等发霉变质，有的还能引起人和动植物的病害。
我国在1950年发生的麦锈病和1974年发生的稻瘟病，
使小麦和水稻分别减产了60亿公斤。
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——微生物基础
发酵工业常用的霉菌
曲霉属(Aspergillus)：
曲霉为多细胞，菌丝有隔膜，营养菌丝大多匍匐生长，无假根
分生孢子着生在顶囊的小梗上，分生孢子梗从特化了的菌丝细胞生出，顶端膨大成顶囊
顶囊表面生辐射状小梗，小梗单层或双层，顶端分生孢子串生
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——微生物基础
黄曲霉
黑曲霉
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——微生物基础
黄曲霉
米曲霉
酸性蛋白酶
淀粉酶
大豆发酵食品
酱油、豆酱等
曲霉属的菌种具有很多活力强大的酶，可制成酶制剂
淀粉酶 ：α-淀粉酶和糖化型淀粉酶
黑曲霉的糖化酶活性最为强大
蛋白酶
果胶酶
黄曲霉、黑曲霉等
酸性或中性蛋白酶
果汁和果酒的澄清
米曲霉、黄曲霉、黑曲霉等
柠檬酸生产
主要菌种：黑曲霉
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——微生物基础
发酵工业常用的霉菌
青霉属(Penicillium)：
多细胞，菌丝有隔膜，有分枝。
分生孢子结构与曲霉不同，分生孢子梗顶端不膨大，无顶囊。
经多次分枝产生几轮小梗，小梗顶端产生成串分生孢子，状如扫帚。
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——微生物基础
代表种：
产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
橘青霉(Penicillium citrinum)
娄地青霉(Penicillium roqueforti)
展开青霉(Penicillium patulum)
应用：是生产抗生素的重要菌种，如产黄青霉和橘青
霉都能生产青霉素，展开青霉用于生产灰黄霉素。
生产有机酸，如葡萄糖酸、柠檬酸。
娄地青霉能将甘油三酸酯氧化为甲基酮。
产黄青霉还能作为霉腐试验菌。
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——微生物基础
2.常见的工业微生物
根霉属(Rhizopus)
什么是根霉？
根霉属于单细胞生物，菌丝无分隔。
根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。
根霉的用途很广，其淀粉酶的活力很高，酿酒工业上多用它作淀粉质原料的糖化菌。根霉能产生有机酸，如反丁烯二酸、乳酸、琥珀酸等，还能产生芳香族酯类物质，根霉亦是转化甾体化合物的重要菌类。
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——微生物基础
黑根霉(Rhizopus nigricans)
米根霉(Rhizopus oryzae)
华根霉(Rhizopus chinensis)
无根根霉(Rhizopus arrhizus)
应用：产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等
在酿酒工业上常用做糖化菌
有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸
黑根霉是微生物转化甾体化合物的重要霉菌
华根霉是中国酒药和酒曲中的重要霉菌
根霉的代表属
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——微生物基础
2. 常见的工业微生物
红曲霉属(Monascus)
菌丝呈红色或紫色，可由我国南方红曲中分离得到生长温度范围为26~42℃，最适温度32~35℃，最适pH为3.5~5.0。
应用：产生一些酶类，如淀粉酶、蛋白酶等
柠檬酸、琥珀酸、乙醇、麦角甾醇等
产生红曲霉红素和红曲霉黄素
例如紫色曲霉(Monascus purpureus)等可用以生
产食用红色色素。
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——微生物基础
2.常见的工业微生物
2.4酵母(Yeast)
什么是酵母？
酵母菌是一类单细胞
真菌的俗称，分类学
上分属于子囊菌纲和
半知菌类。
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——微生物基础
酵母菌的主要特征: 1.个体一般以单细胞状态存在； 2.无性繁殖包括芽殖、裂殖和产生无性孢子，而 芽殖是酵母菌最常见的繁殖方式； 3.有性繁殖主要以形成子囊和子囊孢子 4.能发酵糖类产能； 5.细胞壁常含有甘露聚糖； 6.喜在偏酸性、糖分高的水生环境中生长；
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——微生物基础
1. 酵母菌属
例：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)
2. 裂殖酵母属(Schizosaccharomyces）
3. 假丝酵母属(Candida)
例：热带假丝酵母(Candida tropiculis)、解脂假丝酵母(Candida lipolyticu)和产朊假丝酵母(Candida utilis)
4. 毕赤氏酵母属(Pichia)和汉逊氏酵母属(Hansenula)
5. 球拟酵母属(Torulopsis Berlese)
6. 红酵母属(Rhodotorula Harrison)
酵母菌的代表属
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——微生物基础
应用：
啤酒酵母是酿造啤酒典型的上面发酵酵母，也是发酵工业最常用的酵母，除了酿造啤酒、酒精及其他饮料酒外，还可发酵制面包。
卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis) 是丹麦的卡尔斯伯啤酒厂分离出来的一种底面发酵酵母，是酿造啤酒最早采用的酵母。
由非洲本地人饮用的粟酒中分离出的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，发酵最适温度为37℃，可发酵糊精得到高产量的酒精。
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应用：
产朊假丝酵母的蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高产朊假丝酵母能利用五碳糖和六碳糖，即能利用造纸工业的亚硫酸纸浆废液。还能利用糖蜜、土豆淀粉废液、木材水解液等生产人畜可食用的单细胞蛋白。
解脂假丝酵母氧化烃类能力很强 ，是石油发酵脱蜡和制取单细胞蛋白的较优良菌种。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为一种新型的基因表达宿主菌有如下优点：高表达、高稳定、高分泌、高密度生长以及可用甲醇严格控制表达。
汉逊氏酵母属能产乙酸乙酯，可用于发酵生产酱油，增加其香味，能利用酒精为碳源，因此也常是酒类饮料的污染菌。
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——微生物基础
应用：
球拟酵母属能生产甘油等多元醇，在230~290℃石油馏分中培养能得到相当于烃类质量70％的菌体。
红酵母属可用于生产脂肪，有的种类对正癸烷、正十六烷及石油有弱氧化作用，并能合成β－胡萝卜素、 －丙氨酸、谷氨酸和蛋氨酸等。
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——微生物基础
2.常见的工业微生物
2.5 噬菌体(Bacteriophage, Phage)
噬菌体属于非细胞型微生物，是侵染细菌、放线菌等细胞型微生物的病毒，专性活细胞内寄生，具有严格的宿主特异性。
特点：
形体微小，必须在电子显微镜下才能看到，可以通过细菌过滤器；
无细胞结构，主要由核酸和蛋白质构成；
营专性寄生，需在活体细胞中生长，并且对寄主细胞有严格的专一性。
生物化工反应单元操作
——微生物基础
大肠杆菌T2噬菌体构造
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——微生物基础
噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分为吸附、侵入、增殖、成熟和释放五个阶段。
根据与宿主的关系，可将噬菌体分为烈性噬菌体和温和性噬菌体。
凡是能引起寄主细胞迅速裂解的噬菌体，称为烈性噬菌体，受感染的细菌称为敏感性细菌。
温和性噬菌体感染细胞后，并不马上引起细胞裂解，而是以“原噬菌体”（Prophage，亦称前噬菌体）方式整合在宿主的DNA中，随寄主繁殖而延续传代。含有温和性噬菌体的细菌通常称作溶原性细菌。
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(1)污染现象
凡利用细菌和放线菌作为生长菌株的发酵工业，均存在噬菌体的危害问题。
(2)异常现象
碳源和氮源的消耗减慢，发酵周期延长，含菌数下 降、pH异常、菌体产生畸形。
噬菌体的防治
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——微生物基础
(3) 防治措施
要防治噬菌体的危害，首先要建立“防重于治”的观念。
至今最有效的防治噬菌体染菌的方法是以净化环境为中心的综合防治法，主要有净化生产环境、消灭污染源、改进提高空气的净化度、杜绝排放活菌体、保证纯种培养、做到种子本身不带噬菌体、轮换使用不同类型的菌种、使用抗噬菌体的菌种、改进设备装置、消灭“死角”以及药物防治等措施。
噬菌体的防治
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