资源简介

(共60张PPT)
模块十一 新型分离技术
01
任务一 认识膜分离技术
02
任务二 认识吸附分离技术
03
任务三 认识色谱分离技术
04
任务四 选择分离方法
05
06
综合案例
总结与归纳
03任务三 认识色谱分离技术学习目标：（1）学习色谱分离设备的结构、工艺流程和工作原理；（2）会操作色谱分离设备；（3）能够分析、判断和解决色谱分离生产中发生的生产问题。03任务三 认识色谱分离技术色谱分离法又称层析法：它利用不同组分在两相中物理化学性质（如吸附力、分子极性和大小、分子亲和力、分配系数等）的差别，通过两相不断的相对运动，使各组分以不同的速率移动，而将各组分分离。03任务三 认识色谱分离技术子任务1认识色谱分离装置认识与了解常用色谱分离设备的结构、工作原理、特点，以便正确选用合适的色谱分离设备。03任务三 认识色谱分离技术一、认识色谱分离设备1.色谱分离设备不同的色谱方法，其工艺构成有所不同，下面以柱色谱为例作介绍。柱色谱系统主要由进样及流动相供给装置、色谱柱、检测器及流分收集装置、控制器等几部分构成。典型的色谱分离工艺设备构成如图所示。03任务三 认识色谱分离技术（1）进样及流动相供给装置在制备型和工业型色谱系统中，流动相供给装置一般包括储液罐、高压泵、液体混合室及梯度洗脱系统。此外，进样体积大时，进样器需附带输液泵。有时为了保护昂贵的色谱柱，在色谱柱前需加上一支预处理柱。高压泵主要用来输送流动相，分恒压和恒流两种基本类型。03任务三 认识色谱分离技术（2）色谱柱色谱柱是实现料液中各种组分有效分离的关键装置，可以是内装色谱剂的玻璃柱或金属柱。柱的入口端应有进料分布器，使进入柱内流动相分布均匀并有规则的流型。柱的底部用以支持固定相的，可以是玻璃棉或砂芯玻璃板等。对分离过程的温度有严格要求，色谱柱具有双层管结构，管间可通水保温。图示是一种常见的色谱柱的结构示意。色谱柱由腔体、液体分配板、集液板、流动相进出口构成。03任务三 认识色谱分离技术一般情况下，柱的分离效率与柱长成正比，与柱的直径成反比。色谱柱通常是细长的，一般L／D=20～30，柱直径大多为2～15cm。柱径大时，样品的负载量增加，但流动很难均匀，分离效果差；柱径小时，进样量少，装柱困难。色谱柱的装填好坏，直接影响分离效果，因此，装柱要采取适宜方法，确保装填均匀。03任务三 认识色谱分离技术（3）检测器与流分收集装置通过检测器连续监测柱底出口处液体中各组分的浓度变化，可以了解样品中各组分的分辨情况。根据组分的物理化学特性，如紫外吸收性、荧光性、电导率、旋光性及可见光光密度，选择适当的在线检测仪器。流分收集器是将底部流出的液体，每次按一定量分别收集的仪器。有滴数式、容量式、质量式等若干种。03任务三 认识色谱分离技术（4）控制器为了对整个色谱分离过程进行严格的监控，需对色谱系统配置计算机控制系统。计算机控制系统可以将各组件运行情况实时显示在屏幕上，便于操作者随时监控系统运行情况，记录并生成相关运行文件，同时对系统运行进行相关控制。03任务三 认识色谱分离技术在色谱分离过程中存有两相，一相是固定不动的，称为固定相；另一相则不断流过固定相，称为流动相。使含有待分离组分的流动相（气体或液体）通过一个固定于柱中或平板上与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力（分配、吸附、离子交换等）的大小、强弱不同，随流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出，达到分离与检测的目的。03任务三 认识色谱分离技术固定相（在柱色谱中也称为柱填料）通常是一些具有特定的分离性质、一定粒度和刚性的颗粒均匀的多孔物质，如吸附剂、离子交换剂、反相填料等。减少固定相粒度，可提高分离柱效，但流动阻力增加，需要加压流动相才能过柱。液相色谱的流动相（在柱色谱中也称为洗脱剂）通常由混合溶剂以及一些添加剂（如无机盐、酸等）组成。流动相对分离组分要有一定的溶解度、黏度小、易流动、纯度要高。03任务三 认识色谱分离技术色谱分离应根据被分离物质的结构和性质，选择合适的固定相和流动相，使分配系数K值适当，以实现分离的目的。因此，固定相和流动相的选择是色谱分离的关键。与其他分离方法相比，色谱分离具有分离效率高、应用范围广、选择性强、分离速度快、检测灵敏度高、操作方便的优点，但它的处理量小、不能连续生产。因此，色谱分离主要运用于物质的分离纯化、物质的分析鉴定、粗制品的精致纯化和成品纯度的检查等。03任务三 认识色谱分离技术二、色谱分离分类①吸附色谱利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附与解吸能力的差异而达到分离的一种色谱方法。②分配色谱利用各组分在两种互不混溶溶剂间的溶解度差异来达到分离的一种色谱方法。③离子交换色谱利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同而达到分离的一种色谱方法。④凝胶色谱（排阻色谱）利用惰性多孔物（如凝胶）对不同组分分子的大小产生不同的滞留作用，而达到分离的一种色谱方法。⑤亲和色谱利用生物大分子和固定相表面存在某种特异亲和力，进行选择性分离的一种色谱方法。03任务三 认识色谱分离技术①柱色谱将固定相颗粒装填在金属或玻璃柱内进行色谱分离。②纸色谱用滤纸作为固定相进行色谱分离。③薄层色谱把吸附剂粉末做成薄层作为固定相进行色谱分离。柱色谱是最常见的色谱分离形式，它具有高效、简便和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制化合物的纯化。03任务三 认识色谱分离技术①气相色谱分气液色谱和气固色谱两种。②液相色谱分液固色谱和液液色谱两种。③ 超临界色谱超临界是流体处于高于临界压力与临界温度时的一种状态。超临界流体性质介于液体和气体之间，具有气体的低粘度。液体进高密度特性，扩散系数位于两者之间。超临界色谱可处理高沸点、不挥发试样，比液相色谱有更高的柱效和分离效率。03任务三 认识色谱分离技术子任务2认识色谱分离工艺流程一、认识凝胶过滤色谱分离工艺流程（一）凝胶过滤色谱的基本原理凝胶过滤层析的分离过程是在装有多孔物质(交联聚苯乙烯、多孔玻璃、多孔硅胶等)作为填料的柱子中进行的。填料的颗粒有许多不同尺寸的孔，这些孔对溶剂分子而言是很大的。故它们可以自由扩散出入。如果溶质分子也足够小，则可以不同程度地往孔中扩散，同时还做无定向的运动。大的溶质分子只能占有数量比较少的大孔，较小的溶质分子则可以进入一些尺寸较小的孔中，所以溶质的分子越小，可以占有的孔体积就越大。比凝胶孔大的分子是不能进入凝胶的孔内，只能通过凝胶颗粒之间的空隙，随流动相一起向下流动，首先从层析柱中流出。所以整个样品就按分子的大小依次流出层析柱，谱图上也就依次出现了不同分的色谱峰了。03任务三 认识色谱分离技术03任务三 认识色谱分离技术（二）凝胶过滤色谱分离设备和工艺流程凝胶过滤色谱设备比较简单，在实验室里用的凝胶层析过滤设备是作为分析设备使用。如图所示为实验室里测定核酸、蛋白质的凝胶层析过滤设备。需要测定的溶液在一定的压力下通过层析柱，根据其分子量的大小依次流出层析柱，在7的检测仪中可以直接检测出核酸或蛋白质的含量。03任务三 认识色谱分离技术典型的SN-01凝胶色谱分析仪及其流程，从贮液瓶出来的溶剂经加热式除气器除去所溶的气体后进入柱塞泵，由泵压出的溶剂再经一个烧结不锈钢过滤器，进入参比流路和样品流路。在参比流路中，溶剂经参比柱、示差折光检测仪的参比池进入废液瓶；在样品流路中，先经六通进样阀将配好的试样送入色谱柱，样品经色谱柱分离后经示差折光检测器的样品池，进入虹吸式体积标记器。示差折光检测器将浓度检测信号输入记录仪，记录纸上记录的是反映被测物质的分子量分布的凝胶色谱图。03任务三 认识色谱分离技术03任务三 认识色谱分离技术如图所示分离不同的蛋白质的凝胶过滤层析设备，依据分子量的大小将不同的蛋白质分离开来。凝胶过滤层析测定蛋白质03任务三 认识色谱分离技术（1）工业用不锈钢中压凝胶过滤层析设备根据要分离的（植物有效成分、化工中间体、化合物等）在通过装于层析柱内的凝胶过滤层析介质时，分离成不同的成分，从而得到的有效组成或成分，对于制备高效药、小剂量的中药、植物有效成分、化学中间体等产品是非常重要的精制手段。适用于高含量单体的分离、中药中杂质的清除地精制、化工中间体、合成产品的精制、合成药单体的分离。所选用的凝胶过滤层析介质为琼酯类、聚乙烯类、多糖类等。所适用溶剂：稀酸、稀碱、有机溶剂（例：乙酸乙脂、氯仿、乙醇）。此类设备操作方便，生产成本底，工作效率高，层析柱装填方便。03任务三 认识色谱分离技术（2）工业用聚乙烯凝胶过滤层析设备层析柱为聚乙烯的凝胶过滤层析设备，适用于植物、中药有效成分地分离植物、中药有效成分地精制植物、中药中杂质的清除地精制。所选用的凝胶过滤介质可以是硅胶、葡聚糖类等，所用的溶剂可选用酸、碱、乙醇、甲醇、丙酮。此类设备更换填料方便，通用性强，操作简单、能耗小、效率高。03任务三 认识色谱分离技术（3）不锈钢凝胶过滤层析设备特别地适用于植物、中药有效成分地分离植物、中药有效成分地精制植物、中药中杂质的清除地精制、化工中间体、合成产品的精制。所选用的凝胶过滤介质可以是硅胶、氧化铝等。适用溶剂：稀酸、稀碱、有机溶剂（例：乙酸乙酯、氯仿、乙醇）。03任务三 认识色谱分离技术（三）凝胶过滤色谱介质凝胶过滤色谱介质简称凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，有一定的孔径和交联度。它们不溶于水，但在水中有较大的膨胀度，具有良好的分子筛功能。它们可分离的分子大小的范围广，相对分子质量在102～108范围之间。03任务三 认识色谱分离技术凝胶是凝胶过滤色谱的核心，是产生分离的基础。要达到分离的要求必须选择合适的凝胶。凝胶过滤层析介质是凝胶过滤层析的基础，直接影响着凝胶过滤层析分离效果。03任务三 认识色谱分离技术1.聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖凝胶又称交联葡聚糖凝胶，是最早发展的有机凝胶，先用发酵的方法以蔗糖为培养基制备成高分子量的葡聚糖，然后用稀盐酸降低其分子量，再用环氧氯丙烷交联形成颗粒状的凝胶。交联前平均分子量低的葡聚糖可制备成渗透极限低的凝胶填料；交联前平均分子量高的葡聚糖可制备成渗透极限高的凝胶填料。适用于水、二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇及水和低级醇的混合物，主要用于分离蛋白质、核酸、酶、多糖类及生化体系的脱盐等。03任务三 认识色谱分离技术2.多孔硅胶多孔硅胶是一种广泛采用的无机凝胶。它的制备一般分为二步，第一步是制成球形小孔硅胶，第二步扩孔，使硅胶的孔径扩大。制备原料硅胶的方法有两种，第一种是将中和了的硅酸钠和硫酸反应液喷雾在油相成球或用悬浮聚合的方法使硅酸乙酯悬浮聚合而获得细颗粒硅胶。扩孔的方法主要是掺盐高温焙烧。多孔硅胶的化学惰性、热稳定性和机械强度好，硅胶的颗粒、孔径尺寸稳定，与各种溶剂无关，因此可在柱中直接更换溶剂，使用方便，使用寿命也长。需要注意的是多孔硅胶的吸附问题，可用于水和酸体系，但不能用于强碱性溶剂。03任务三 认识色谱分离技术3、琼酯糖凝胶（Sepharose）琼酯糖凝胶来源于一种海藻，也是一种有机凝胶，主要是由D-乳糖和3，6-脱水-L-乳糖为残基组成的线性多聚糖。琼酯糖在无交联剂的存在下也能自发形成凝胶。琼酯糖凝胶按照一定浓度在加热条件下将琼酯糖全部溶解，得到均匀的溶液作为分散相；将分散剂等物质加入到如苯、甲苯、二氯甲烷、环乙烷、四氯化碳等有机溶剂中，充分搅拌加热作为连续相；将琼酯糖热溶液加入到连续相中，不断搅拌，琼酯糖溶液被分散成粒径大小合适的液滴；逐步降温到琼酯糖基本定型，不断搅拌，使其凝固成一定强度的颗粒；过滤分离，去油、洗涤，得到未交联的琼酯糖。琼酯糖与交联剂（环氧氯丙烷、2，3-二溴丙醇等）进行反应，制成凝胶。琼酯糖还可以进行二次交联，成为刚性或半刚性成品，提高其机械稳定性和通渗性等。03任务三 认识色谱分离技术二、认识离子交换色谱工艺流程1.认识离子交换色谱在软水器内装有Na式阳离子交换树脂，含Ca2+的原水流经软水器进入Na式阳离子交换树脂层，因Ca2+与树脂的亲和力比Na+强，所以Ca2+能被Na式阳离子交换树脂吸着，而能将Na式阳离子交换树脂上的Na+置换出来，软水器下面流出来的即为去Ca2+的软化水。这一过程即为离子交换层析过程。03任务三 认识色谱分离技术离子交换层析分离是利用带有可交换离子（阴离子或阳离子）的不溶性固体与溶液中带有同种电荷的离子之间置换离子则使溶液得以分离的单元操作。含有可交换离子的不溶性固体称为离子交换层析介质或离子交换剂或离子交换树脂，若带有可交换阳离子的离子交换剂称为阳离子交换剂，如上面提到的Na式阳离子交换树脂；反之，若带有可交换阴离子的离子交换剂称为阴离子交换剂，如OH式阴离子交换剂。03任务三 认识色谱分离技术2.认识离子交换色谱工艺流程离子交换过程为液固相间的传质过程，其交换过程中所用的设备的搅拌槽、流化床、固定床和移动床等形式。（1）搅拌槽搅拌槽是带有多孔支承板的筒形结构，离子交换层析介质置于支承板上。操作时，将液体通入槽中，通气搅拌，使溶液与离子交换层析介质均匀混合，进行交换反应，待过程衡时，停止搅拌，将溶液排出。这种设备结构简单，操作方便，适用于小规模分离要求不高的场合。03任务三 认识色谱分离技术（2）固定床固定床是目前应用最广的一类离子交换设备。如图所示的活塞式固定床具有上下两个支撑板。交换时，原液自下而上流动，依靠较大流速将离子交换层析介质层推到上方；再生时，再生剂自上而下流动，离子交换层析介质支撑在下部支撑板上。图示的部分流化的活塞式固定床的顶部是固定床，而下部是处于流化状态的离子交换层析介质。这类设备的主要缺点是离子交换层析介质的利用率低。使再生剂和洗涤液的用量大。 03任务三 认识色谱分离技术（3）移动床移动床的具体形式较多，主要有两种不同形式的移动床。希金斯连续离子交换器。它是由交换区、返洗区、脉动柱、再生区、清洗区组成的循环系统，这些区彼此间以自动控制阀A、B、C、D分开。03任务三 认识色谱分离技术操作过程分两个阶段进行，即液体流动阶段和离子交换层析介质移动阶段。在液体流动阶段，各控制阀关闭，离子交换层析介质处于固定床状态，分别通入原水、返洗水、再生液和清洗水，同时进行交换、离子交换层析介质的清洗和再生、再生后的离子交换层析介质的清洗等过程；03任务三 认识色谱分离技术然后转入到离子交换层析介质移动阶段，此时停止溶液进入，打开阀门A、B、C、D，依靠在脉动柱中脉动阀通入液体的作用使离子交换层析介质按反时针方向沿系统移动一段，即将交换区中已饱和的一部分离子交换层析介质送入返洗区，返洗区已清洗的部分离子交换层析介质送入再生区，再生区内已再生好的离子交换层析介质送入清洗区，清洗区内已清洗好的部分离子交换层析介质重新送入交换区，如此循环操作。希金斯连续离子交换器的特点是离子交换层析介质的利用率高，用量少，再生剂消耗量少，设备紧凑，占地少。03任务三 认识色谱分离技术Avco连续离子交换层析移动床离子交换装置，它的主体由反应区、清洗区和驱动区构成。介质连续地从下而上移动，在再生区、清洗区和交换区分别与再生液、清洗液和原水逆流接触完成分离过程，离子交换层析介质的移动靠两个驱动器来完成的。这种离子分离设备比希金斯连续离子交换器更为优越，利用率高，再生效率也高，但技术难度大。03任务三 认识色谱分离技术（4）流化床流化床离子交换设备，主要有柱形和多级段槽形，还可分为单层和多层两种。可以间歇操作，也可以连续操作。连续逆流式多级流化床操作，用于水的软化处理。该流化床包括一系列的多孔配水盘，并带有导流管用于离子交换剂的逆流，该设备相对较小，处理量通常在10~100m3/h.03任务三 认识色谱分离技术Himsley连续逆流多级流化床，是改进的多层流化床。由离子交换层析介质和一液体进口管组成垂直床层，对处理含有悬浮固体微粒的溶液很有潜力。可处理大约含5000mg/h悬浮固体微粒的溶液。03任务三 认识色谱分离技术3.认识离子交换色谱的介质具有离子交换功能的材料可分为有机的和无机的两大类。无机离子交换剂是一些水合氧化物、多价金属的酸性盐、杂多酸盐、铝硅酸盐或亚铁氰化物。这些无机离子交换剂与有机的离子交换树脂相比，虽然具有耐高温、耐辐射、对碱金属有较好的选择性等优点，但它们的吸附容量小，一些物理和化学性能不够稳定，应用的方面是有限的。03任务三 认识色谱分离技术离子交换树脂的分类03任务三 认识色谱分离技术（1）强酸性阳离子交换树脂此类树脂功能基为磺酸基—SO3H的一类树脂。它的酸性相当于硫酸、盐酸等无机酸，在碱性、中性乃至酸性介质中都有离子交换功能。以苯乙烯和二乙烯苯共聚体为基础的磺酸型树脂是最常用的强酸性阳离子交换树脂。在生产这类树脂时，使主要单体苯乙烯与交联剂二乙烯苯共聚合，得到的球状基体称为白球。白球用浓硫酸或发烟硫酸磺化，在苯环上引入一个磺酸基。磺化后的树脂为H+型，为贮存和运输方便，往往转化为Na+型。03任务三 认识色谱分离技术（2）弱酸性阳离子交换树脂此类树脂以含羧酸基的为多，母体有芳香族和脂肪族两类。用二乙烯苯交联的聚甲基丙烯酸可以作为一个代表，聚合单体除甲基丙烯酸外，也常用丙烯酸。含膦酸基—PO3H2的树脂，酸性稍强，有人把它从弱酸类分出来，称为中酸性树脂。膦酸基树脂的离解常数约在10-3～10-4数量级，而羧酸基树脂的离解常数多在10-5～10-7数量级。膦酸基树脂往往是交联聚苯乙烯用三氯化磷在AlCl3催化下与之反应，然后经碱解和硝酸氧化而得到。03任务三 认识色谱分离技术（3）强碱性阴离子交换树脂此类树脂的功能基为季铵基。其骨架多为交联聚苯乙烯。在傅氏催化剂，如ZnCl2、AlCl3、SnCl4等存在下，使骨架上的苯环与氯甲醚进行氯甲基化反应，再与不同的胺类进行季铵化反应。季铵化试剂有两种。使用第一种(三甲胺)得到I型强碱性阴离子交换树脂，I型树脂碱性甚强，即对OH-的亲和力很弱。当用NaOH使树脂再生时效率较低。为了略为降低其碱性，使用第二种季铵化试剂（二甲基乙醇胺），得到Ⅱ型强碱性阴离子交换树脂，Ⅱ型树脂的耐氧化性和热稳定性较I型树脂略差。03任务三 认识色谱分离技术（4）弱碱性阳离子交换树脂此类树脂是一些含有伯胺—NH2、仲胺—NRH或叔胺—NR2功能基的树脂。基本骨架也是交联聚苯乙烯。经过氯甲基化后，用不同的胺化试剂处理。与六次甲基四胺反应可得伯胺树脂，与伯胺反应可得仲胺树脂，与仲胺反应可得叔胺树脂。有的胺化试剂可导致多种胺基的生成。如用乙二胺胺化时，生成既含伯胺基，又含仲胺基的树脂。交联聚丙烯酸用多烯多胺H2N(C2H4N)mH2作胺化剂时，也生成含两种胺的树脂。除与碳相连的氮原子外，其余氮原子均有交换能力，所以这种树脂的交换容量较高。弱碱性树脂的品种较多。03任务三 认识色谱分离技术（5）螯合性树脂此类树脂功能基为胺羧基—N(CH2COOH)2，能与金属离了生成六环螯合物。（6）氧化还原性树脂此类树脂功能基具氧化还原能力，如硫醇基—CH2SH、对苯二酚基等。（7）两性树脂此类树脂同时具有阴离子交换基团和阳离子交换基团。比如同时含有强碱基团—N(CH3)3+和弱酸基团—COOH，或同时含有弱碱基团—NH2和弱酸基团—COOH的树脂。03任务三 认识色谱分离技术一些具有特殊功能或特殊用途的树脂，如热再生树脂、光活性树脂、生物活性树脂、闪烁树脂、磁性树脂等。03任务三 认识色谱分离技术三、认识亲和色谱工艺流程1.亲和色谱的原理许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性，如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，都具有这种特性，生物分子间的这种专一结合能力称为亲和力。依据生物高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合的原理，采用一定技术，把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则含有目的产物的混合物(流动相)流经此固定相后，可把目的产物从混合物中分离出来，此中分离技术称为亲和色谱。03任务三 认识色谱分离技术亲和色谱分离示意。把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能的情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入色谱柱中(a)，然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在有利于固定相配基与目的物质形成配合物的条件下进入色谱柱。这时，混合液中只有能与配基发生结合反应形成配合物的目的物质(·分子)被吸附(b)，不能发生结合反应的杂质分子(△分子)直接流出。经清洗后，选择适当的洗脱液或改变洗脱条件进行洗脱(c)，使被分离物质与固定相配基解离，即可将目标产物分离纯化。03任务三 认识色谱分离技术一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的亲和吸附介质(固定相)。固体粒子称为配基的载体。作为载体的物质应具有：①不溶性的多孔网状结构，渗透性好；②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；③具有亲水性，无非特异性吸附；④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固定化；⑤抗微生物和酶的侵蚀；⑥最好为粒径均一的球形粒子。常用的载体有葡聚糖、聚丙烯酰胺等，近年来多孔硅胶和合成高分子化合物载体正在被开发应用于亲和色谱。03任务三 认识色谱分离技术亲和配基可选择酶的抑制剂、抗体、蛋白质A、凝集素、辅酶和磷酸腺苷、三嗪类色素、组氨酸和肝素等。当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用，如图(a)所示。如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合，如图(b)所示。03任务三 认识色谱分离技术2.亲和色谱的操作亲和色谱包括进料吸附、清洗、洗脱和介质再生几个步骤。吸附操作要保证吸附介质对目标产物有较高的吸附容量，杂质的非特异性吸附要控制在尽可能低的水平。一般杂质的非特异性吸附与其浓度、性质、载体材料、配基固定化的方法以及流动相的离子强度、pH和温度等因素有关。为了减小吸附操作中的非特异性吸附，所用的缓冲液的离子强度要适当，缓冲液的pH应使配基与目标产物及杂质的静电作用较小。03任务三 认识色谱分离技术料液流速是影响色谱速度和效果的重要因素。提高流速虽可加快分离速度，但会降低柱效。此外，琼脂糖容易受压变形，压力过大反而流速降低。清洗操作目的是洗去介质颗粒内部和颗粒间空隙中的杂质，一般使用与吸附时相同的缓冲液。03任务三 认识色谱分离技术目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时，可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否复性。洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充以备下次使用。03任务三 认识色谱分离技术3.亲和色谱的应用及特点亲和色谱专一性高，操作条件温和，过程简单，纯化的倍数可达几千倍级，能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离极为有效，它是一种专门用于分离纯化生物大分子的色谱分离技术。亲和色谱最初用于蛋白质特别是酶的分离和精制上，后来发展到大规模应用于酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离精制上。在生物化学领域，主要用于各种酶、辅酶、激素和免疫球蛋白等生物分子的分离分析。03任务三 认识色谱分离技术03任务三 认识色谱分离技术03任务三 认识色谱分离技术子任务1

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