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培优讲座：　
基因工程
专题 基因工程
一、核心知识回顾
二、高考高频考点
核心知识回顾
1.基因工程的3种基本工具： 、 和 。
2.基因工程操作的基本程序：
(1) ; (2) （核心）;
(3) ; (4) 。
一个完整的基因表达载体包括： ，
目的基因的位置在： 。
3.DNA粗提取的原理： 。
4.鉴定DNA的方法及现象： 。
5.筛选合适的目的基因较为有效的方法：从相关的 和 的基因中进行筛选。
6.认识基因结构和功能的技术方法： 技术、 数据库、 工具（如BLAST）等为人类找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
核心知识回顾
7.获取目的基因的3条途径： 、 和 。8.限制酶的作用： ____________________________________________________。9.DNA连接酶的分类及作用：__________________________________________。10.与单酶切相比，双酶切的优点是：______________________________________。11.标记基因的作用：__________________________________________________。
12.启动子的作用： ____________________________________________________。13.终止子的作用： ___________________________________________________。14.PCR技术的原理：__________________________________________________。15.PCR技术的条件：__________________________________________________。16.PCR技术扩增缓冲液中一般含有 ，作用为 。17.PCR技术复制的原料实际为 （dATP、dTTP、dCTP、dGTP），作用是：____________________________________________________________________。
18.PCR技术的三步分别是：____________________________________________。
核心知识回顾
19.PCR技术引物的本质：_____________，根据____________________设计而成。20.引物的作用：_______________________________________________________。21.PCR反应中加入引物的原因：________________________________________。22.鉴定PCR扩增产物的的方法：________________________________________。23.PCR扩增仪的温度升高到90℃的目的：_________________________________， 变性温度过低可能导致：_____________________________________________。24.PCR扩增仪的温度下降到50℃左右的目的：_____________________________， 复性温度过高可能导致：_____________________________________________； 复性温度过低可能导致：_____________________________________________。
24.PCR扩增仪的温度下降到50℃左右的目的：_____________________________，
复性温度过高可能导致：_____________________________________________；
复性温度过低可能导致：_____________________________________________。25.PCR扩增仪的温度上升到72℃左右的目的：_____________________________，
延伸时间过长可能导致：_____________________________________________。
25.PCR扩增仪的温度上升到72℃左右的目的：_____________________________，
延伸时间过长可能导致：_____________________________________________。
核心知识回顾
26.PCR技术能直接扩增mRNA吗？___________________________________。27.PCR技术中的相关计算：
第一轮 第二轮 第三轮 第n轮
DNA 总数
含引物A或B的DNA分子数
同时含引物A和B的DNA分子数
共消耗引物数
长链-中链的DNA分子数
中链-短链的DNA分子数
短链-短链的DNA分子数
核心知识回顾
28.将目的基因导入3种受体细胞的方法：①植物细胞：基因枪法、 和 。②动物细胞： 。③微生物细胞： 。29.在农杆菌转化法中，两次拼接：第一次拼接：__________________________________________________________;第二次拼接：__________________________________________________________。30.在农杆菌转化法中，两次导入：第一次导入：__________________________________________________________;第二次导入：__________________________________________________________。
31.在农杆菌转化法中，目的基因的位置在：________________________________。
目的基因的检测与鉴定的目的：（1）检查目的基因进入受体细胞后， 。（2）检查 。
核心知识回顾
32.目的基因分子水平检测的3个层次：① 检测目的基因是否插入到转基因生物的DNA上： 。② 检测目的基因是否转录出了mRNA： 。③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质： 。33.个体生物学水平的鉴定的内容： ， 如 接种实验；基因工程产品与天然产品的功能进行 。
核心知识回顾
1.基因工程的3种基本工具： 限制酶 、 DNA连接酶 和 载体 。
2.基因工程操作的基本程序：
(1)目的基因的筛选和获取; (2)基因表达载体的构建（核心）;
(3)将目的基因导入受体细胞; (4)目的基因的检测与鉴定。
一个完整的基因表达载体包括：启动子+目的基因+终止子+标记基因+复制原点，
目的基因的位置在：_在启动子和终止子之间。
3.DNA粗提取的原理：_DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精。
4.鉴定DNA的方法及现象：_DNA和二苯胺在沸水浴条件下呈蓝色。
5.筛选合适的目的基因较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
6.认识基因结构和功能的技术方法： 测序技术、 序列数据库、序列比对工具（如BLAST）等为人类找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
核心知识回顾
7.获取目的基因的3条途径： 人工合成 、从基因文库中获得和利用PCR获取和扩增 。
8.限制酶的作用： 能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
9.DNA连接酶的分类及作用：E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，形成磷酸二酯键。
10.与单酶切相比，双酶切的优点是：防止目的基因和质粒的自身环化，防止目的基因和质粒的反向连接。
11.标记基因的作用：鉴别和筛选含有重组质粒的受体细胞。
12.启动子的作用： RNA聚合酶的识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
13.终止子的作用： 使转录在需要的地方停下来。
14.PCR技术的原理：DNA的半保留复制。
核心知识回顾
15.PCR技术的条件：模板、原料、酶、能量、引物和缓冲液。
16.PCR技术扩增缓冲液中一般含有Mg2+ ，作用：激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶。
17.PCR技术复制的原料实际为 dNTP （dATP、dTTP、dCTP、dGTP），作用是：为合成DNA子链提供原料和能量 。
18.PCR技术的三步分别是：变性、复性和延伸。
19.PCR技术引物的本质：单链DNA，根据目的基因两端的核苷酸序列设计而成。
20.引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
21.PCR反应中加入引物的原因：DNA复制不能从头开始，DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链。
22.鉴定PCR扩增产物的的方法：琼脂糖凝胶电泳。
核心知识回顾
23.PCR扩增仪的温度升高到90℃的目的：使双链DNA解聚为单链，
变性温度过低可能导致：DNA双链解聚不完全。
24.PCR扩增仪的温度下降到50℃左右的目的：使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
复性温度过高可能导致：不利于引物与模板结合，导致PCR过程没有产物；
复性温度过低可能导致：引物与模板的结合位点增加，非特异性扩增产物增多。
25.PCR扩增仪的温度上升到72℃左右的目的：使溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
延伸时间过长可能导致：非特异性扩增产物增加。
26.PCR技术能直接扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
核心知识回顾
第一轮 第二轮 第三轮 第n轮
DNA 总数 2 4 8 2n
含引物A或B的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A和B的DNA分子数 0 2 6 2n－2
共消耗的引物数 2 6 14 2n+1－2
27.PCR技术中的相关计算：
核心知识回顾
第一轮 第二轮 第三轮 第n轮
长链-中链的DNA分子数 2 2 2 2
中链-短链的DNA分子数 0 2 4 2n－2
短链-短链的DNA分子数 0 0 2 2n－2n
27.PCR技术中的相关计算：
长链条数：始终是最初DNA分子的两条链。
中链条数：始终是最初DNA分子的两条长链为模板形成的，并且每复制一次，新形成的中链增加两条。
短链条数：所有的DNA分子中，除长链和中链外，余下的即为短链。
核心知识回顾
28.将目的基因导入3种受体细胞的方法：
①植物细胞：基因枪法、 花粉管通道法 和 农杆菌转化法 。
②动物细胞：显微注射法 。
③微生物细胞：Ca2+处理法。
29.在农杆菌转化法中，两次拼接：
第一次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上;
第二次拼接：插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
30.在农杆菌转化法中，两次导入：
第一次导入：将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌;
第二次导入：含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）。
核心知识回顾
31.在农杆菌转化法中，目的基因的位置在：在T－DNA中。
目的基因的检测与鉴定的目的：
（1）检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
（2）检查转基因生物是否培育成功 。
32.目的基因分子水平检测的3个层次：
① 检测目的基因是否插入到转基因生物的DNA上：PCR（结合电泳检测）等技术、DNA分子杂交技术。
② 检测目的基因是否转录出了mRNA： PCR（结合电泳检测）等技术、分子杂交技术。
③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原——抗体杂交。
33.个体生物学水平的鉴定的内容：表达产物是否具有生物学活性（个体是否具有相应性状）， 如抗虫和抗病接种实验；基因工程产品与天然产品的功能进行 活性比较 。
高考高频考点
考点1 限制酶的选择
考点2 引物的选择、设计和计算
考点3 基因工程操作程序
高考调频考点——限制酶
1.回答下列问题:已知在新霉素抗性基因内部存在Hind Ⅲ识别序列，质粒的其他部位和目的基因内部均无XbaⅠ、SacⅠ、HindⅢ三种限制酶的识别位点，
假设tPA基因为680bp，若只选择SacⅠ对目的基因和质粒进行酶切，缺点是__________________________________________________；
若选择Xba Ⅰ、Sac Ⅰ对目的基因和质粒进行酶切，缺点是___________________________；因此最好选用____________________对目的基因和质粒进行酶切。操作成功后的结构长___________bp。
不能避免目的基因的自身环化和反向连接
无法筛选空质粒和重组质粒
Xba Ⅰ、Hind Ⅲ
12037
13603－2246+680＝12037
①目的基因自身环化
②质粒自身环化
方法总结：单酶切的缺点
③目的基因与质粒反向连接，使目的基因不能正确表达
2.图中的质粒需用 和 切开，才能与目的基因(t-PA改良基因）片段高效连接。
BglⅡ
Xma Ⅰ
高考调频考点——限制酶
①选目的基因两端和载体都有的酶切位点；
②所选酶切位点不能破坏目的基因和标记基因。
方法总结：选择酶切位点的原则
③切割质粒时，至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
3.（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如上图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
D
高考调频考点——限制酶
4.（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接
C
高考调频考点——限制酶
5．2022·福建·统考高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：
（一）基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH与加入的脱氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。
5'→3'
高考调频考点——限制酶
5’
3’
5’
3’
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列、抗性基因序列如图1所示。用Xho I和Sal 1分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA，可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是：
，
，
，培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）
高考调频考点——限制酶
（二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图2所示：培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
(3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。
(4)步骤②所用的SP2/0细胞的生长特点是 。
高考调频考点——限制酶
CD14蛋白/CD14抗原
分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞
能在体外无限增殖
（二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图2所示：培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
(5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据 原理，需加入 进行专一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体，原因是
。
(6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14抗体，用于检测巨噬细胞。
高考调频考点——限制酶
抗原—抗体杂交
CD14蛋白
参与形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类多，有的不能分泌抗CD14抗体
小鼠腹水
[2023湖北卷-T22] 构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。
高考调频考点——DNA连接酶
④
点拨：DNA连接酶能连接DNA片段时，脱氧核苷酸链延伸方向是5'端→3'端，即上一个脱氧核苷酸脱氧核糖的-OH和下一个脱氧核苷酸的磷酸基团的-H发生脱水缩合。
A
T
C
G
T
A
G
C
5’
3’
5’
3’
磷酸二酯键
1.（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题∶
(1)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为____________________________________________________________。
(2)若用PCR技术扩增 psy基因和crtI基因，需要分别在不同的PCR扩增仪中加入__种引物，其作用是______________________________________________。
高考调频考点——引物
2
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能将单个脱氧核苷酸连续结合至双链 DNA 片段的引物链上
引物与DNA模板链通过碱基互补配对结合，使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，从而延伸DNA子链
(3)在利用PCR技术扩增R（抗旱）或 r 基因过程中，利用__________可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。
(4)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设
计的2组引物（图5）都不合理，请分别说明理由。
①第1组：________________________________________;
②第2组：________________________________________。
(4)科研过程中，可用PCR技术检测受体细胞是否成功转入了目的基因。提取转染后的细胞的全部DNA分子，用目的基因的引物扩增。扩增完毕后，检测发现扩增产物中除目的基因外，还有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有： ________。
①模板受到污染；②退火温度过高；③引物太短；④延伸温度偏低。
高考调频考点——引物
①③
引物
引物I和引物II局部发生碱基互补配对
引物I自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2.（2018年江苏卷）为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因，利用基因工程大量制备α-淀粉酶。为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_________端加上限制性酶切位点，且常在2条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是 ________________________________
_______________________________________________________________________________。
高考调频考点——引物
5’
保证目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化
知识点拨：引物的3‘端为结合模板DNA的关键碱基,一般不能改造，5'端无严格限制,可用于添加限制酶切割位点等序列。
3.PCR过程经过4次循环，第4次循环时需要的引物的数量是 个，4次循环一共需要的引物的总数量是 个。第4轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
高考调频考点——引物
16
15/16
30
n次循环需要的引物数＝2n+1－2
3次循环需要的引物数：24－2＝14
4次循环需要的引物数：25－2＝30
第4次循环需要的引物数：30－14＝16
第4次循环产物中含引物A的DNA分子所占比例：（24－1）/16=15/16
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
4.（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
高考调频考点——引物
细胞外
P1、P6
高考调频考点——引物
5'-ATTCCA-3'
5．（2023·湖南·统考高考真题）(2)某家系中甲病的基因突变如下图所示：正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'研究人员拟用PCR扩增突变基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点
为
） 酶切检测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6个碱基即可）。
突变基因:
5'-ATTCCA TATC…… （293个碱基）…… CCATGCCCAG-3'
3'-TAAGGTATAG……（293个碱基）…… GGTACGGGTC-5'
3'-GTACGG-5'
5'-ATTCCA-3'
高考调频考点——引物
Q1：引物是什么？
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
长度约为20~30个核苷酸。
细胞中：一段单链RNA，PCR中：一段人工合成的单链DNA。
Q2：为什么需要引物？
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
Q3：引物的作用？
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
Q4:设计引物的依据是？
目的基因两端的核苷酸序列。
高考调频考点——引物
Q5:为什么延伸时需要加入两种引物？
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。
Q6:两种引物与模板链的哪一端配对？
引物的5′端与模板链的3′端互补配对
3’
5’
3’
5’
Q7:引物设计的要求（或引物失效的原因）？
a.引物自身不能环化。
b.两种引物之间不能发生碱基互补配对。
高考调频考点——引物
Q8:引物的3‘端和5‘端哪个能改造？
引物的3‘端为结合模板DNA的关键碱基,一般不能改造，5'端无严格限制,可用于添加限制酶切割位点等序列。
可在引物的5’端加上限制酶的识别序列。
Q9:为了便于将扩增的DNA片段与运载体连接，可如何操作？
使目的基因定向（正确）插入载体并避免目的基因自身环化。
Q10:在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列,主要目的是？
1．（2023·全国统考高考真题）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指：
。
高考调频考点——基因表达载体的构建
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；
图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
高考调频考点——基因表达载体的构建
终止子
启动子
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
密码子具有简并性
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。
能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
1．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
高考调频考点——综合考查
重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖。
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
RNA聚合酶
高考调频考点——综合考查
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
核染色体DNA
被标记的目的基因的单链DNA片段
实验设计思路：
通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质。

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