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第三章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
导入
扩增
从社会中来
转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
基因工程
就是按照人们的愿望（定向），通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
选必三 P67
操作对象
操作水平
操作环境
操作原理
结果
优点
基因
DNA分子水平
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因重组
克服远缘杂交不亲和的障碍；
定向改造生物的遗传特性。
生物体外
抗病毒基因
重组
DNA分子
“切割”
“拼接”
番木瓜体细胞
导入
表达
为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位
② 生物界共用一套遗传密码
③ 遗传信息的传递都遵循中心法则
为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
①DNA的基本组成单位都是4种脱氧核苷酸
②都遵循碱基互补配对原则
③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
基因工程诞生的理论基础
抗病毒基因
重组
DNA分子
“切割”
“拼接”
番木瓜体细胞
导入
表达
准确切割DNA分子的“分子手术刀”
将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的
“分子运输车”
限制性内切核酸酶
DNA连接酶
载体
DNA分子极小，实现这些精确操作需要哪些“分子工具”呢？
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
1. 来源：
主要从原核生物中分离纯化来的
数千种
2. 种类：
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
【P72资料卡】限制酶名字的由来
限制酶是如何命名的呢？是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个(拉丁文)字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如，一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR Ⅰ。
①粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcesens)中分离的第一种限制酶为_______；
②流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离出3种限制酶，则分别命名为：_______________________________。
Hind Ⅰ、Hind Ⅱ、 Hind Ⅲ
Sma Ⅰ
简称：限制酶
5'
3'
5'
3'
T
A
G
G
T
A
T
C
C
A
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
（1）能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列（特异性），
（2）使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
3. 作用：
磷酸二酯键
作用部位
限制酶识别的核苷酸序列由几个核苷酸组成？
限制酶所识别序列的特点是：
1.呈现碱基互补对称
2.都可以找到一条中心轴线
3.中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列
在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
4. 限制酶的识别序列
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
【反馈练习】
1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
EcoR Ⅰ
(在G与A之间切割)
中轴线
黏性末端
平末端
Sam Ⅰ
(在G与C之间切割)
产生黏性末端或平末端
5. 实例：
识别特定序列为GAATTC；
切割特定部位为G、A之间的磷酸二酯键
6. 切割结果：
EcoR I 限制酶和Sma I 限制酶
识别特定序列为CCCGGG；
切割特定部位为C、G之间的磷酸二酯键
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
例：限制酶EcoRI的识别序列和切点是－G↓AATCC－，补充完整切割过程图：
限制酶SmaI的识别序列和切点是－GGG↓CCC－，补充完整切割过程图：
—G
—CTTAA
AATTC—
G—
—GAATTC—
—CTTAAG—
EcoRI
—GGG
—CCC
CCC—
GGG—
—GGGCCC—
—CCCGGG—
Sma I
黏性末端
平末端
两种末端的正确书写
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
随堂练习
1. 下列黏性末端最可能由同种限制酶切割而成的是( )
2. 请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。
①
②
③
B
倒转180°，完全相同则为同一种限制酶切割
3
提示：如图
3.写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ ________
随堂练习
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。
【P71旁栏思考题】你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
【P74拓展应用1】为什么限制酶不切割细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
g1
g2
g3
现有一段DNA，含有g1、g2、g3，若要将g2提取出来，如何操作？
拓展思维
需要有几个酶切位点？
2
产生几个末端？共产生几个磷酸基团？
4
4
使用EcoRⅠ酶剪切
识别序列GAATTC
g1
g2
g3
CT TCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGAT T
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
5‘
5‘
3‘
3‘
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
如果想把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
生物A基因片段
生物B基因片段
产生相同的黏性末端。
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
两DNA片段要具有相同且互补的黏性末端才能拼起来
注意：用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键
不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
18
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
1. 作用：
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 只能连接____________ 连接____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
2. 种类：
【P72旁栏思考题】DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA聚合酶
3.DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
4.几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
限制酶
DNA连接酶
基因工程的基本工具
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
【反馈练习】
1.根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
【反馈练习】
2.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、
DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(　　)
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
C
你能用DNA连接酶将他们连接起来吗？
2和 3和 ；
1和 ；
4和 。
7
6
5
8
旋转180度
判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端可能是用同一种限制酶切割
1. 作用：
作为运输工具，与外源/目的基因的DNA片段结合，将外源基因送入受体细胞中。在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2. 种类：
三、基因进入受体细胞的载体 —“分子运输车”
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌
等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
3.最常用的载体——质粒
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
其基因属于细胞质基因。
4.载体需具备的条件：
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害，易分离。
——便于重组DNA分子的筛选
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。
3.为什么不能直接将目的基因导入受体细胞？？
1.质粒上有一个或多个限制酶切点，有什么作用？
思考：
供外源基因或外源DNA片段插入其中。
2.质粒上有标记基因，有什么作用？
便于重组DNA的筛选、鉴定和选择。
目的基因不能自主复制，不能稳定存在并遗传给后代。
大肠杆菌及质粒结构模式图
普通的细菌一般是对抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四环素的培养基中______（能/不能）生长。如果给普通细菌导入一个含有四环素抗性基因的质粒，四环素抗性基因的____________可使细菌获得抵抗四环素的性状。 在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
敏感
不能
表达产物
【思考】如何利用标记基因筛选呢？
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：
重组DNA分子的模拟操作
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
实例：重组DNA分子的模拟操作
载体
目的基因
选必三 P73
思考·讨论：重组DNA分子的模拟操作
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对/bp以上。
质粒的自身环化
由于用同种限制酶切割，会产生相同黏性末端，则可能导致目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。
图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
1. 上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏 和 。
2. 在基因工程的操作中，不宜只选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后， 。
目的基因
抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
练习与应用
2.限制酶的选择原则？
(1)切割目的基因时：能切下目的基因且不破坏目的基因：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)切割质粒时：保留标记基因（至少保留一个完整的标记基因）、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和目的基因反向连接到载体，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
（1）选目的基因两端和载体都有的酶切位点；
（2）所选酶切位点不能破坏目的基因和标记基因。
1. 选择限制酶切割位点的原则
1.“分子手术刀”——
1）来源：
2）作用：
3）作用结果：
2.“分子缝合线”——
1）作用：
2）分类：
3.“分子运输车”——
1）作用：
2）种类：
3）应具备条件：
限制酶
产生黏性末端、平末端
DNA连接酶
将不同的DNA片段连接起来
磷酸二酯键
将外源基因送入受体细胞
质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）
主要从原核生物中分离纯化出来。
载体
识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位：
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
一、概念检测
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C．能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D．只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2．在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A．大肠杆菌的质粒 B．切割DNA分子的酶
C．DNA片段的黏性末端 D．用来识别特定基因的DNA探针
练习与应用 （书本P74-75）
C
A
P75页 2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
（1）Xba Ⅰ。因为 Xba Ⅰ与 Spe Ⅰ切割产生了相同的黏性末端。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别 DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的 DNA 片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
1.实验原理
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
DNA不溶于酒精，
但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，
DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
四、DNA的粗提取与鉴定
思考：
1.如何描述该变化曲线？
2.若DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高，如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；
在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；
当NaCl溶液浓度高于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐升高
先用2mol/L 的NaCl溶液溶解DNA，再加入蒸馏水，使其溶液浓度从2mol/L下降到0.14 mol/L，使DNA在盐溶液中析出
四、DNA的粗提取与鉴定
2.材料用具
（1）材料：
富含DNA的材料，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等、
研磨液、体积分数为95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
（2）用具：
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑;
选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
四、DNA的粗提取与鉴定
(3)试剂及作用：
研磨液：
体积分数为95%的冷酒精：
2mol/L 的NaCl 溶液：
蒸馏水：
二苯胺试剂：
析出DNA（即粗提取DNA）。
溶解DNA（并去除部分杂质蛋白）
滴入NaCl溶液中，使其浓度逐渐下降至0.14mol/L,从而析出DNA
破坏细胞，释放出细胞内的物质。
——鉴定DNA（要现配现用，用棕色瓶保存）
四、DNA的粗提取与鉴定
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
3.方法步骤
（1）通过研磨释放 DNA
称取约30g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
四、DNA的粗提取与鉴定
①研磨的目的：
②研磨时间不宜太长：
③有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶：
④研磨不宜太用力
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
研磨效果好（有利于充分研磨）
（2）过滤获取含DNA的上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，
在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r / min 的转速下离心5 min ，再取上清液放入烧杯中。
为减少 DNA 的损失，过滤过程一般使用纱布
可能含有核蛋白、多糖等杂质
低温放置几分钟的作用：
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
四、DNA的粗提取与鉴定
在上清液中加入体积相等的、预冷（作用同低温）的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min ，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的 DNA 。用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r / min 的转速下离心5 min ，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA ）晾干。
（3）冷却酒精析出DNA
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
四、DNA的粗提取与鉴定
（4）DNA的鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
四、DNA的粗提取与鉴定
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？
用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
结果分析与评价
四、DNA的粗提取与鉴定
评价结果
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
2.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
实验结果不明显的可能原因：
①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：
动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
四、DNA的粗提取与鉴定
结果分析与评价
思考：
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质
四、DNA的粗提取与鉴定
视频演示：DNA的粗提取与鉴定
四、DNA的粗提取与鉴定
进一步纯化DNA
方法一：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
方法二：可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
四、DNA的粗提取与鉴定
方法三：由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
【请同学们补充完整以下实验步骤】
试管编号 A（对照组） B（实验组）
步骤1 2mol/L的NaC1溶液5mL
步骤2 不进行任何处理
步骤3
步骤4 沸水浴加热5min
实验现象 溶液不变蓝色
实验结论
加丝状物或沉淀物
加4mL的二苯胺试剂
溶液逐渐变蓝
DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺试剂会被染成蓝色
四、DNA的粗提取与鉴定

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