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聚焦
学习目标：
1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
第2 节 基因工程的基本操作程序
位于基因的______，紧挨__________________。
二.基因表达载体的构建
1.构建原因
1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成
终止子
启动子
目的基因
标记基因
复制原点
基因
表达载体
当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
1)启动子
一段有特殊序列结构的_______片段。
①本质：
②位置：
转录的起始位点
③功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
诱导型启动子：
（核心）
一段有特殊序列结构的_______片段。
DNA
位于基因的_______。
下游
使转录在所需要的地方停下来。
①作用：
便于重组DNA分子的筛选。
②常见类型：
抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
DNA复制的起始位点。
注意：目的基因必须插入到 与 之间。
2)终止子
①本质：
②位置：
③功能：
3)标记基因
4)目的基因
5)复制原点
启动子
终止子
编码蛋白质的基因，能控制表达所需要的特殊性状；如Bt基因。
终止子
启动子
目的基因
标记基因
复制原点
基因
表达载体
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能
DNA
DNA
mRNA
mRNA
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
重组
DNA分子
DNA连接酶
获取目的基因
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
基因表达载体构建模式图
限制酶
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
质粒
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶
3.构建过程
1)单酶切法
目的基因
单酶切的方法缺陷是什么？
3.构建过程
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
1’
1
2’
正向连接
1)单酶切法
3.构建过程
2)双酶切法
双酶切的优点:
① 防止质粒重新环化
② 防止质粒与目的基因反向连接
③ 防止目的基因自身环化
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
知识扩展：限制酶的选择原则
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中 ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择 和 两种限制酶。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择 ，而不选择 。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择 。
PstⅠ
SmaⅠ
SmaⅠ
PstⅠ
PstⅠ
EcoRⅠ
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
农杆菌转化法（常用）
基因枪法（单子叶植物常用）
花粉管通道法
1.方法
——显微注射法
—— Ca2+转化法
（我国科学家独创）
三.将目的基因导入受体细胞
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
1)花粉管通道法
①用_____________将_________________________直接注入______中；
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
② 在植物受粉后的一定时间内，剪去______，将____________滴加在___________上，使目的基因借助_____________进入_______；
柱头
DNA溶液
花柱切面
花粉管通道
胚囊
受体细胞：
受精卵
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。
简便经济，但要求花朵较大
2)农杆菌转化法（采用最多）
①转化：
目的基因进入___________内，并且在受体细胞内维持_______和_______的过程。
受体细胞
稳定
表达
②农杆菌特点
③利用农杆菌进行转化的思路：
a. 能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数_____________没有侵染能力；
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
b. 农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（_______________）转移到被侵染的细胞，并且将其_______________________________；
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的_______作用，就可以使目的基因________________。
Ti质粒的T-DNA
转化
进入植物细胞
④ 农杆菌转化法的过程：
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
植物组织培养
第一次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第一次导入：将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入
两次拼接：
两次导入：
表现出新性状的植株
第二次拼接：指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上(非人工操作)。
第二次导入：指含目的基因的T-DNA导入受体细胞(非人工操作)。
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
过程：
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
① 体积大，易操作。
② 全能性高，易培养成完整个体。
导入动物细胞
3)显微注射法
科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。
病毒侵染法
细胞
处理大肠杆细胞
Ca2+
感受态
与感受态细胞混合
细胞吸收DNA分子
基因表达载体
使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。
注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
导入微生物细胞
4)Ca2+转化法
增加细菌细胞膜的通透性
因为没有内质网、高尔基体
对蛋白质进一步加工。
植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化过程
项目
种类
花粉管通道法或
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
受精卵或体细胞
受精卵
原核细胞
目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达
目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
1.目的
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
2. 检测内容及方法
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原——抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
四.目的基因的检测与鉴定
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法1：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
DNA半保留复制
原理：
是否扩增出目的基因
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
电泳操作
引物如何设定？
1)分子水平的检测
原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
酶切
转膜
标记的DNA/RNA探针
DNA分子杂交（Southern-blot)流程图
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
方法2：
DNA分子杂交技术
碱基互补配对
原理：
1)分子水平的检测
②检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增或分子杂交技术
转基因生物
提取RNA
RNA作为模板
PCR操作
电泳
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
转膜
标记的DNA/RNA探针
RNA
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
1)分子水平的检测
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：
抗原与抗体的特异性结合
原理：
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
转基因生物
放射性检测
（杂交带）
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
抗原— 抗体杂交技术
1)分子水平的检测
2)个体生物学水平鉴定
没有抗虫基因的棉花植株
有抗虫基因的棉花植株
棉铃虫没有死亡
棉铃虫死亡
接种
棉铃虫
以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）
转Bt基因
非转基因
抗虫鉴定、抗病鉴定、抗逆鉴定等
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒植物
抗盐植物
抗除草剂植物
饲喂害虫
害虫死亡
病毒感染（病毒接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
2)个体生物学水平鉴定
第四步：目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
第一步：目的基因的筛选和获取
第二步：基因表达载体的构建
第三步：将目的基因导入受体细胞
利用PCR获取和扩增
人工合成；构建基因文库
目的基因、标记基因、启动子、终止子
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、Ca2+处理法(微生物)
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
---核心
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
(1) afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。
(2) 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。
(3) 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
3.下列关于PCR技术的叙述，正确的是（ ）
A.该技术应用体内DNA半保留原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
B.PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
C.该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D.该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
4.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长

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