资源简介

(共23张PPT)
聚焦
学习目标：
1.基因工程的概念及理论基础
2.基因工程的基本工具
第1 节 重组DNA技术的基本工具
第1课时
情 境 探 究
不用农药的情况下，能让棉花本身就能抗棉铃虫吗？
资料1: 我国是棉花的生产和消费大国，以新疆棉最为著名。在棉花种植过程中，常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。而大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。
资料2:苏云金杆菌有一种杀虫基因/Bt毒蛋白基因，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。
一.基因工程的概念与理论基础
1. 概念：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程
对象
原理
优点
基本过程
基因
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状
基因重组
剪切→拼接
→导入→表达
2.理论基础
1)拼接的基础
①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）
2)表达的基础
②都遵循碱基互补配对原则
③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
①基因是控制生物性状的结构与功能单位
②遗传信息的传递都遵循中心法则
基因在空间上转移并成功表达
③生物界共用一套遗传密码。（相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）。
DNA（基因）
转录
翻译
mRNA
蛋白质
工具
工具酶
分子运输车：　　　。
（１）　　　　　　。
（２）　　　　　　 。
限制酶
ＤＮＡ连接酶
(3)载体
【易错警示】工具酶≠工具
质 粒
λ噬菌体的衍生物
动植物病毒
“手术刀”
“缝合针”
重组DNA技术的基本工具
二.限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
1)来源：
主要是原核生物
T
A
C
G
G
C
A
T
G
C
G
C
A
T
5
3
5
3
4)作用特点：
能够识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
2)化学本质：
蛋白质
3)种类：
数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
1.基础内容
(1)你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
(2)为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
2.识别序列
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
思考·讨论：
中轴线
限制酶所识别的序列，呈现碱基互补对称。无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。
想一想限制酶所识别的序列有什么特点？
Sma I 限制酶只能识别 序列，切割 和 之间的 切开，切割后产生 。
3.作用结果
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
G
G
A
T
C
A
T
C
A
T
A
T
大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ 限制酶能特异性识别_________序列，并切割___和___之间的____________，切割后产生__________。
GAATTC
G
A
磷酸二酯键
黏性末端
1)Eco RI 限制酶
2)Sma I 限制酶
CCCGGG
C
G
磷酸二酯键
平末端
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
限制酶
限制酶
请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
提示：
同种限制酶产生的黏性末端相同，
不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。
4.命名
限制酶是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了三个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例:
E：Escherichia （属名） co：coli （种加词）
R：RY13 （品系）I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；
SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
练习：流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为： 。
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
三.DNA连接酶—“分子缝合针”
将双链___________“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_____________。
DNA片段
磷酸二酯键
1.作用：
2.分类：
类型 来源 功能 相同点 差别
E.coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
能连接黏性末端和
平末端（效率较低）
只能连接黏性末端
恢复磷酸二酯键
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
四.基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
1.作用
2.必要条件
3.种类：
质粒（常用）、噬菌体、动植物病毒等。
①能在宿主细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
②有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
④对受体细胞无害，容易分离。
③常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
①作为运载工具，将外源基因导入受体细胞中
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。
有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。
能复制，并带着插入的目的基因一起复制
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
有切割位点
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
标记基因的筛选原理
导入
受体细胞
培养
加入氨苄青霉素
只有含有载体，并且载体上的抗性基因表达的大肠杆菌才能存活并增殖
含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒）
下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？
1.选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
2.所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。
规律——选择酶切位点的原则：
BamH I 和 Hind III
① 防止目的基因的自身环化
不能用E.coRI 的原因
② 防止目的基因反向连接到载体
图1
图2
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 噬菌体、动植物病毒
小结
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位： 磷酸二酯键
种类：E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针
3.在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作错误的是( )
A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解
C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同
D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞
E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA连接酶连接的重组DNA还能用上面两种酶切割
DE
4.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是(　　)
a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp)
1600；1100；300 800；300
A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接
C.a酶与b酶切断的化学键不相同
D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，
D
序列会明显增多
5.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是（ ）
注：Y为C或T，R为A或G。
A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
限制酶名称　 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ C↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG

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