资源简介

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聚焦
学习目标：
1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
第2 节 基因工程的基本操作程序
培育转基因抗虫棉的简要过程
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
（有抗虫基因）
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
与载体拼接
抗虫基因
（Bt基因）
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
苏云金杆菌
提取
表达Bt基因
1.基因的结构
基因通常是有遗传效应的DNA片段；能编码特定的蛋白质。
放大
DNA片段
编码区上游
编码区下游
能转录相应的mRNA，
进一步编码（翻译）
出蛋白质的DNA区段。
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
基因1
基因2
基因3
一.目的基因的筛选与获取
1)原核细胞的基因结构
非编码区：
不转录，不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列。
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
启动子
终止子
连续的、不间隔的
2)真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
编码区上游
编码区下游
间隔的、不连续的
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列
外显子
内含子
启动子
终止子
【思考】真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？
转录
初级RNA
成熟mRNA
剪切、拼接
DNA聚合酶
单链DNA
cDNA
逆转录酶
逆转录
复制
cDNA不含有非编码序列。即启动子、终止子和内含子。
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
根据不同的需要,目的基因是不同的,它主要是指______________ 。
2.目的基因
1)概念
在基因工程的设计和操作中，用于改变________________或获得________________等的基因。
受体细胞性状
预期表达产物
2)实例
编码蛋白质的基因
a.与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）
b.与优良品质相关的基因
c.与生产药物相关的基因（胰岛素、干扰素基因）
d.与毒物降解相关的基因
e.与工业用酶相关的基因等
3.筛选合适的目的基因
1)方法
a.较为有效的：从相关的___________和___________的基因中进行筛选。
2)实例
已知结构
功能清晰
Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程
用苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
b.利用测序技术、_____________（如GenBank）、_______________（如BLAST）等，找到合适的目的基因。
序列数据库
序列比对工具
4.目的基因的获取
1)获取目的基因的方法：
①人工合成
②利用PCR获取和扩增目的基因
③从基因文库中获取
前提：
方法：
DNA合成仪
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
2)利用PCR获取和扩增目的基因
① PCR的概念：
PCR是________________的缩写,它是一项根据__________________的原理,在体外提供________________的各种组分与反应条件，对____________________ 进行大量复制的技术。
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
参与DNA复制
目的基因的核苷酸序列
② 原理：
③ 操作环境：
④ 目的：
⑤ 优点：
DNA半保留复制。
体外复制（PCR扩增仪/PCR仪）。
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
可以在短时间内大量扩增目的基因。
PCR扩增仪（PCR仪）
解旋酶
DNA聚合酶
▲子链的延伸方向：
模板：
原料：
能量：
酶：
DNA的两条母链
4种游离的脱氧核苷酸
解旋酶、DNA聚合酶
要点回顾:体内DNA复制
条件
5'端→3'端
因为 DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物（通常为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如缓冲液等
耐高温的DNA聚合酶
DNA模板
引物
缓冲溶液
四种脱氧核苷酸
PCR扩增仪（PCR仪）
①条件:
微量离心管
——控制温度
（dNTP）
（2种）
一般添加Mg2+
（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）
3)PCR反应的过程
②基本过程
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
B.复性
（退火）
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
变性 复性 延伸
3)PCR反应的过程
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮循环的产物
完成后，常采用 来鉴定PCR的产物。
琼脂糖凝胶电泳
3)PCR反应的过程
③扩增结果：
以指数形式扩增，即____（n为扩增循环的次数）
2n
若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。
若开始有N个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。
2n
N 2n
变性
90℃以上
延伸
72℃左右
复性
50℃左右
基本过程
3)PCR反应的过程
1.引物是一小段能与 的
短单链核酸，通常为20-30个核苷酸。
DNA母链的一段碱基序列互补配对
2.在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。
引物与目的基因模板链的 端结合。
从子链的5′端向3′端延伸
3′
【拓展练习】
1.PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？
不相同。但PCR反应时所用引物是人工加入的一小段DNA
体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA
思考讨论
2.PCR过程中需要加入两种引物，原因是？
3.两种引物的要求？（理解）
DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，不能从头合成，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。
①引物自身不能环化
②两种引物之间不能互补配对
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合
比较PCR技术与体内DNA复制
项目 PCR技术 体内DNA复制
相 同 点 原则 原料 条件 不 同 点 场所
解旋方式
酶
引物
特点
ATP
温度条件
结果
体外复制（主要在PCR仪内）
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶催化
DNA在高温下变性解旋
解旋酶、DNA聚合酶
小段RNA或单链DNA分子
一小段RNA
体外迅速扩增
生物体内边解旋边复制
不需要
需要
在较高温度下进行
细胞内温和的条件
短时间扩增大量DNA片段
形成完整的DNA分子
碱基互补配对原则
四种脱氧核苷酸
均需要模板（脱氧核苷酸双链）、能量、酶等
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
4)从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
①基因文库的种类
基因组文库
部分基因文库
含有一种生物所有基因的文库
只含有一种生物部分基因的文库
（如：cDNA文库）
互补DNA
②基因文库的构建：
将DNA片段与载体连接
导入受体菌中储存
a.基因组文库的构建
提取某种生物的全部DNA
多个一定大小的DNA片段
基因表达载体
用适当的限制酶切割
基因组文库
b.部分基因文库（如cDNA文库）构建
提取某种生物某器官或特定发育时期的mRNA
单链互补DNA
双链DNA片段
基因表达载体
与载体连接
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
mRNA
逆转录酶
核酸酶H
RNA-DNA杂交双链
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
与载体连接
导入受体菌中储存
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）
基因多少
物种间的基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以

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