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第一章发酵工程第2节
二 微生物的选择培养和计数
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
一、选择培养基
1.概念：
2.方法：
分离得到酵母菌、霉菌等
分离固氮菌
分离自养型微生物
不加含碳有机物的无碳培养基
不加氮源的无氮培养基
加入青霉素的培养基
（1）在培养基中加入某种化学物质。
分离得到金黄色葡萄球菌
加入高浓度食盐的培养基
（2）改变培养基中的营养成分。
（3）改变微生物的培养条件。
耐高温微生物
高温环境下培养
厌氧型微生物
兼性厌氧型
无氧环境下培养
思考·讨论 选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
讨论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
进一步思考：
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
思考·讨论 选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是_______________；该类培养基的主要用途为_______________。
2.从用途上来讲，培养基二属于_____培养基，目的是为了获得_________。
3.两种培养基共有的培养基成分有：_____________________；
培养基一的碳源为_______，氮源为_______；
培养基二的碳源为_______，氮源为_______。
培养基一 牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二 KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
固体
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数
选择
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
【对点训练】
1.方法：
二、微生物的选择培养
由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行________，然后再将菌液_____到制备好的____________上。
充分稀释
涂布
选择培养基
稀释涂布平板法
2.基本操作：
和 。
梯度稀释
涂布平板
①铲取土样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
1mL
1ⅹ10
90mL无菌水
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
②取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
3.操作过程：
二、微生物的选择培养
（1）梯度稀释
微量
移液器
二、微生物的选择培养
（2）涂布平板
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养。
[特别提醒]
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；
2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；
3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
二、微生物的选择培养
(1)筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为液体培养基。( )
提示：选择培养基一般为固体培养基。
(2)能分解尿素的细菌之所以能分解尿素，是因为其能产生脲酶。( )
(3)稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数( )
(4)平板划线法不仅能纯化细菌，也能计数( )
×
√
√
×
[典型例题] (2021·陕西汉中模拟)利用稀释涂布平板法纯化的大肠杆菌，经培养后发现培养基上出现了多种菌落，不可能的原因是(　　)
A.培养基制备过程中被杂菌污染
B.接种过程中，无菌操作不符合要求
C.系列稀释时，无菌操作不符合要求
D.使用涂布器时涂布不均匀
解析　出现杂菌污染的原因可能有培养基制备过程中被杂菌污染；接种过程中，无菌操作不符合要求；系列稀释时，无菌操作不符合要求等，A、B、C不符合题意；使用涂布器时涂布不均匀会导致菌落分布比较集中，不会导致杂菌污染，D符合题意。
D
[变式训练] 某学者欲研究被石油污染过的土壤中的细菌数并从中筛选出能分解石油的细菌。下列有关操作错误的是(　　)
A.利用平板划线法对细菌进行计数
B.利用以石油为唯一碳源的培养基筛选能分解石油的细菌
C.采用稀释涂布平板法分离菌种
D.称取土壤和稀释土壤溶液时应在酒精灯火焰旁操作
解析　平板划线法能对细菌分离纯化但不能计数，通常将被石油污染过的土壤浸出液稀释后，采用稀释涂布平板法分离分解石油的细菌菌种，并对菌种进行计数，A错误，C正确；筛选能分解石油的细菌只能利用以石油为唯一碳源的选择培养基，B正确；称取土壤和稀释土壤溶液过程中的每一步都要在酒精灯火焰旁操作，D正确。
A
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
②计数原则:
因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
三、微生物的数量测定
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
M代表稀释倍数；
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
例1：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
B
三、微生物的数量测定
③计算公式：
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
例2. 某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
请评价这两位同学的实验结果的有效性：
1.甲同学____________________________________；
原因是____________________________________。
2.乙同学____________________________________；
原因是____________________________________。
实验操作不合理
未设置重复实验组
结果计算不合理
21与另外两组数值相差太大，应舍去
三、微生物的数量测定
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
不能区分死菌与活菌；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
2.直接计数 —计数板计数法
①原理：利用细菌计数 板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
②缺点：
三、微生物的数量测定
第2节
第2课时 微生物的选择培养和计数
（2）
1.实验目的：
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
2.实验原理：
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
[资料卡]常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
①提供无机盐；
②调节pH。
3.实验设计
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【小组探究】请结合课本P19的相关信息，小组讨论，设计操作步骤、实验数据统计表格。（5min）
操作步骤：
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）土壤取样
（2）配制培养基
（3）样品的稀释与涂布平板
（4）微生物的培养与观察
取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤
取样过程：铲去表土（一般3cm左右）
注意事项：铁铲和取样袋在使用前都要灭菌；事毕洗手。
选择培养基*以尿素为唯一氮源
完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）——作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（3）样品的稀释与涂布平板
选择培养基
（平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照)
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
*细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d
②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取数目稳定时的记录作为结果。
*防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
提示：如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
提示：如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
提示：如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（5）结果分析与评价
【对点训练】请说明下列各组培养基的目的并预测正常情况下各组的菌落生长情况。
①3组已接种的选择培养基：
__________________________________________________
②1组已接种的牛肉膏蛋白胨培养基：
__________________________________________________
③未接种的选择培养基：
__________________________________________________
④未接种的牛肉膏蛋白胨培养基：
__________________________________________________
对土壤中分解尿素的细菌分离和计数；
判断选择培养基是否具有选择作用；
验证选择培养基中是否含有杂菌；
验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌；
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
可分离得到单菌落。
可得到多种菌落。
无菌落。
无菌落。
补充拓展：
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
方法：在培养基中加入酚红指示剂
呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。
——鉴别培养基
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
pH升高，酚红指示剂变红
补充拓展：
脲酶阴性
脲酶阳性
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
(1)从土壤中取样时，土层越浅越好( )
(2)来自土壤的微生物稀释倍数越大越好( )
(3)测定不同微生物数量时，接种的土壤悬浮液的稀释度相同( )
(4)菌落特征是鉴别菌种的重要依据( )
(5)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量( )
×
×
×
√
×
[典型例题1] (2021·四川绵阳期末)某同学将1 mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58。下列叙述错误的是(　　)
A.可得出土壤样液中活菌大约为5.7×107个/L
B.此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低
C.一般选择菌落数为30～300的平板进行计数
D.显微镜直接计数法统计的是稀释液中的活菌数
D
[典型例题2] (2021·山东淄博月考)下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述.正确的是(　　)
A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B.统计样品中的活菌数目一般用平板划线法
C.筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质
D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌
解析　统计样品中的活菌数目时一般用稀释涂布平板法，B错误；筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一氮源，培养基中还应含有水、无机盐、碳源等营养物质，C错误；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则表明筛选到了分解尿素的细菌，D错误。
A
[变式训练] (2021·襄阳五中调研)下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是(　　)
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红
B
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
结果分析评价
平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
接种效果图
相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
接种环
涂布器
从最后划线的区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落
②用于计数
①都能分离纯化菌种
②都是在固体培养基上进行的
一、概念检测
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
课本P20 练习与应用
√
√
√
D
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40%-60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合
物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌
为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（1）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌,请你给出详细的实验方案。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。
纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
二、拓展应用

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