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第二节 通过植物体细胞杂交
获得新的植物体
奇思妙想：
地上长番茄，
地下长马铃薯
讨论：
用传统的有性杂交方法能得到这种后代吗？为什么？
不能；因为两种植物
之间存在着生殖隔离
1978年梅尔彻斯等首次利用
获得了马铃薯和番茄的属间体细胞杂种“马铃薯-番茄”植株。
科研实践：
植物体细胞杂交技术
植物体细胞杂交就是将两个来自不同种植物的体细胞融合成一个杂种细胞， 并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。
番茄细胞
马铃薯细胞
＋
→
杂种细胞
困难： 阻碍着细胞间的融合
细胞壁
思考：如何去掉细胞壁呢？
酶解法（纤维素酶和果胶酶）
番茄细胞
马铃薯细胞
番茄原生质体
马铃薯原生质体
去除细胞壁
纤维素酶和果胶酶
原生质体定义：利用酶解法去除植物细胞壁后的细胞结构，包括细胞膜、细胞质和细胞核，球形。
注意：与原生质层的区别
显微镜下的球形原生质体
拓展：原生质体与原生质层的区别
指的是脱去细胞壁的细胞。动物细胞也可看做是原生质体。
原生质体
成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质。
原生质层
VS
原生质层不包括细胞液和细胞核
原生质体
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡
细胞核
原生质层
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡膜
细胞液
番茄原生质体
马铃薯原生质体
原生质体的优点：
①没有了坚硬致密的细胞壁的阻碍，植物细胞之间的融合得以实现；
②原生质体也更容易被导入外源基因，是植物基因工程的理想受体；
③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
通过植物体细胞杂交获得新的植物体
（原生质体的获取、融合与植物组培）
1 成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
2 由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的性状
0.5~0.6mol/L的甘露醇
（或一定浓度的蔗糖）
(较高渗透压)
纤维素酶、果胶酶
目的使细胞处于微弱的质壁分离状态，这样有利于完整的原生质体的释放，防止原生质体被破坏。
球形的
原生质体
植物
细胞
材料选择：分裂旺盛，再分化能力强的（植物的年龄、生长发育状态等），如根尖、愈伤组织或悬浮培养细胞等。
可用无菌的G6玻璃砂漏斗过滤灭菌。
1.原生质体的获取、培养
1 成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
如何纯化？
思考：如何纯化原生质体？
沉降法（低速离心法）：最常用的方法，将过滤和离心相结合，置于离心管离心，原生质体沉于离心管底部，残液碎屑漂浮于上清液；去上清液后，再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中反复3次。
影响原生质体分离的数量和质量的因素：材料的种类和生理状态；酶的种类、酶解时间和温度；酶液的浓度；分离与纯化的方法等。
0.5~0.6mol/L的甘露醇
（或一定浓度的蔗糖）
(较高渗透压)
纤维素酶、果胶酶
目的使细胞处于微弱的质壁分离状态，这样有利于完整的原生质体的释放，防止原生质体被破坏。
球形的
原生质体
植物
细胞
材料选择：分裂旺盛，再分化能力强的（植物的年龄、生长发育状态等），如根尖、愈伤组织或悬浮培养细胞等。
可用无菌的G6玻璃砂漏斗过滤灭菌。
1 成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
纯化方法：
沉降法（低速离心法）
需检测原生质体的活力，如何检测？
1.原生质体的获取、培养
思考：原生质体活力如何检测？
已学内容 检测方法
观察叶绿体和细胞质流动
胞质环流法
通过模拟实验探究膜的透过性
染色法
氧摄入量评价法
荧光标记法
形态观察法
观察植物细胞的质壁分离及质壁分离复原现象
渗透吸水或失水
举例：荧光标记法(FDA法)
FDA本身没有极性，无荧光，可以穿过细胞膜自由出入细胞，在细胞中不能积累。在活细胞中，FDA经酯酶分解为荧光素，后者为具有荧光的极性物质，不能自由出入细胞膜，从而在细胞中积累。在紫外光照射下，发出绿色荧光。相反如果是死细胞，则不会发出绿色荧光。
0.5~0.6mol/L的甘露醇
（或一定浓度的蔗糖）
(较高渗透压)
纤维素酶、果胶酶
目的使细胞处于微弱的质壁分离状态，这样有利于完整的原生质体的释放，防止原生质体被破坏。
球形的
原生质体
植物
细胞
材料选择：分裂旺盛，再分化能力强的（植物的年龄、生长发育状态等），如根尖、愈伤组织或悬浮培养细胞等。
可用无菌的G6玻璃砂漏斗过滤灭菌。
1 成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
纯化方法：
沉降法（低速离心法）
原生质体活力检测：荧光标记法、染色法、形态观察法、胞质环流法、氧摄入量评价法
1.原生质体的获取、培养
科研实践的一些成果：
1960年英国植物生理学家科金用酶解法去除植物
细胞壁，分离出了植物原生质体。
1971年科研人员首次由原生质体获得了烟草再生植株。
据不完全统计，至少有400多种植物的原生质体经培养后成功再生植株。我国科研人员已获得50多种植物的原生质体再生植株。
意义：原生质体培养成功标志着植物细胞工程技术又向前迈进了一步，为植物细胞工程和基因工程的研究提供了先进的实验体系，具有重要的理论研究和实际应用价值。
番茄原生质体
马铃薯原生质体
正在融合的原生质体
物理手段：电刺激、离心、
振荡
化学手段：聚乙二醇（PEG）
原理： 细胞膜的流动性
2.原生质体融合
2 由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的性状
电刺激法进行细胞融合示意图
电融合仪
电激法 装置图
显微镜下的融合
电刺激
思考：
原生质体融合过程，培养基中可能出现哪些细胞类型？
番茄原生质体(A)
马铃薯原生质体(B)
诱导融合后的产物是混合物：
①未融合的细胞： A、B
②两两融合的细胞：AA、BB、AB
③多细胞融合体
④部分融合
在一定密度的细胞群体下进行
获得杂种细胞需要进行鉴定和筛选
可能是异种融合细胞
拓展：鉴定和筛选杂种细胞的常用方法：
（1）机械选择法。利用两种原生质体的某些可见标志（如形态、颜色等差异），对融合产物进行鉴别，筛选出杂种细胞进行单独培养。对于在形态、颜色上难以区分的原生质体融合形成的异核体，可利用不同荧光素分别标记两亲本的原生质体，然后进行诱导融合，在荧光显微镜下选择同时带有两种荧光标记的杂种细胞。
（2）互补选择法
这种方法的原理是利用现成的或诱发产生的各种缺陷型或抗性型的突变体细胞作为融合实验的材料。由于突变体均不能在特定的选择培养基上生长，而能在该培养基上正常生长的是互补的杂种细胞，因此可将其筛选出来。
（3）组织培养筛选法
根据植物细胞对培养基成分和培养条件的要求与反应不同，可作为选择杂种细胞的依据。利用这种特性或人为地造成杂种细胞生长和分化能力的差异来进行杂种细胞的选择。
正在融合的原生质体
杂种细胞
诱导成功的标志：融合的原生质体
经培养后再生出新的细胞壁
影响原生质体再生壁的因素：
植物基因型、供体细胞的分化程度、
培养基成分、渗透压、有些植物
加聚乙二醇有利于细胞壁发育
再生出 细胞壁
注意：再生出细胞壁是其能进行有丝分裂的前提，且再生细胞壁之后，应逐步降低渗透压。
再生出细胞壁
的杂种细胞
愈伤组织
杂种植株
移栽后的植株
3.植物组织培养
实例：1978年梅尔彻斯等用植物体细胞杂交技术培育出的 “马铃薯-番茄”植株，外型倾向于番茄植株，花和叶具有杂种的特点，并结有畸形的小果实，但在根部没有形成块茎。
杂种植物需要鉴定和选育
（杂种细胞具有全能性）
局限：不一定能让杂种植株按人们的要求表现出
亲代性状
可能原因：①杂种细胞融合/培养过程中也可能出现
染色体的丢失、结构异常等；
②番茄基因可能抑制了马铃薯块茎生成基因的表达，
或者相互影响。
拓展：杂种植株鉴定的方法有形态学鉴定、细胞学鉴定、DNA分子标记鉴定等，其中最有效的方法是DNA分子标记鉴定。
2 由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的性状
美国的科学家曾经选择了两种烟草进行细胞融合。融合的细胞再经过培养，长成了一株面目一新的烟草，它兼有双亲高产和抗病害的优点,而且能直接繁育后代，一个优良的新品种就此产生！
白菜
甘蓝
白菜—甘蓝
已获得多种植物种间、属间甚至是科间的杂种细胞、愈伤组织，有些还分化成苗。
植物体细胞杂交技术的优点：
打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍
×
A细胞
A原生质体
B细胞
再生出细胞壁
愈伤组织
杂种植株
移栽后的植株
B原生质体
正在融合的原生质体
植物体细胞杂交
原生质体获取、融合
植物组织培养
总结：植物体细胞杂交
植物细胞
原生质体
融合的原生质体
去除细胞壁
杂种细胞
植株
融合
组培
再生细胞壁
纤维素酶果胶酶
PEG融合法
电融合法
离心法
①植物体细胞杂交的结果是杂种植株；属于可遗传变异类型（染色体畸变）；
②原理：细胞膜具有一定的流动性，植物细胞的全能性；
③杂种细胞的鉴定和筛选以及杂种植株的鉴定和选育是获得真正杂种的必要过程；
④意义：克服远缘杂交不亲和的障碍、培育新品种。
小结：植物体细胞杂交
通过植物体细胞杂交获得新的植物体
（原生质体的获取、融合与植物组培）
1 成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础
2 由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的性状

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