资源简介

(共42张PPT)
案例：小明是一名高二的同学，在高二上学期的假期的一次打篮球中，突然大腿关节比较痛，及时到遵义医学院检查，不幸确诊为类风湿性关节炎（RA）。主要病症为关节软组织肿胀、关节骨损伤，严重时可以导致残废。被称为“不死的癌症”。
回顾自己所学知识：
类风湿性关节炎（RA）是什么类型疾病？该如何治疗？
抗TNF抗体（阻断TNF作用过程）
资料1：作为，免疫细胞的分泌的炎症因子的代表 —TNF， 能够激活滑膜成纤维细胞过量表达组织蛋白酶，分解骨骼和软骨中的胶原蛋白，进而导致软骨和骨骼破坏关节侵蚀。另外TNF也能激活破骨细胞形成，进而溶解骨质。假如你是药物研发人员,请研发一种治疗药物，为患者带来希望。
1.大量的抗TNF抗体是如何制备的？该技术在临床上还有那些应用？
TNF
TNF受体
动物细胞融合技术与单克隆抗体
第2节 第2课时
第2章 细胞工程
学习目标
目标
01
02
03
结合具体实例，以流程图的形式表示单克隆抗体的制备过程。（科学探究）
运用结构与功能观，理解动物细胞融合技术的原理和过程。（生命观念）
说明单克隆抗体的特点及应用。
（社会责任）
知识回顾：
现在学习：
什么是细胞融合？人细胞和小鼠细胞如何融合在一起？
必修1 第三章第1节
以前学习：
这一实验以及相关的其他实验证据表明，细胞膜具有流动性。
实例：1970年，
人—鼠细胞荧光标记融合实验
血清
（抗体主要分布部位）
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
2、缺陷：
所得抗体的产量低、纯度低，特异性差
血清含量有限
怎么获得既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体的细胞？
动物细胞融合杂交细胞动物细胞培养单克隆抗体骨髓瘤细胞（能无限增殖）一种B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体）杂交瘤细胞一个极富创造力的方案1975年，米尔斯坦和科勒1984年，诺贝尔生理学或医学奖1.动物细胞融合技术的概念、原理、结果
是什么？
2.诱导动物细胞融合的常用方法有哪些？
与植物体细胞杂交技术相比，特有的是哪种方法，其原理是怎样的？
3、动物细胞融合技术有什么意义？
请小组合作，分析回答以下问题：
活动一：【小组讨论】
1.概念：
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2.结果：
形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
3.原理：
细胞膜具有一定的流动性
4.诱导融合的常用方法：
PEG融合法
电融合法、离心法
灭活病毒诱导法
（动物细胞特有）
5.意义：
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。
一
动物细胞融合技术
细胞核
病毒颗粒
灭活的病毒黏附于细胞表面
细胞质膜被病毒颗粒穿通
细胞质膜融合 ，细胞质流通
形成杂交细胞
融合实质及完成的标志
6.构建动物细胞融合模型：
①融合过程:细胞膜融合→细胞质融合→ ________融合。
②重组细胞的特点: 具有____________________,杂种细胞表现出两个____________的特点。
③融合后的杂交细胞经过__________后仍能形成两个完整的杂交细胞。
动物细胞A
动物细胞B
膜融合、质融合
动物细胞培养
杂交细胞（单核）
物理、化学、生物法诱导
细胞核
亲本细胞
有丝分裂
两种细胞的遗传信息
动物细胞融合实质及完成的标志
7. 应用：
正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞
①至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。
②成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
③为制造单克隆抗体开辟了新途径。
（主要）
飞马？
处理方法
诱导手段
结果
原理
请同学们看图对比动物和植物细胞融合的异同：
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
意义
主要用途
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
聚乙二醇（PEG）融合法、电融合法、离心法；高Ca2+-高pH融合法
聚乙二醇（PEG）融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
资料：20世纪90年代初，英国科学家成功地利用“生物导弹”单克隆抗体瞄准并杀死了癌细胞，使患血癌的一名67岁退休教授与一名女患者的癌细胞奇迹般消失了。被称为“生物导弹”的单克隆抗体，能够跟踪和杀死细菌、病毒或癌细胞。
1.定义：机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
2.抗体的分布：
1）血清（主要）
2）组织液及外分泌液（如乳汁中）
体液免疫
抗体
1）每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体
2）体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上
抗体
结合图2-16: 米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程的示意图，尝试用构建制备抗TNF单克隆抗体的流程（每个小组自己讨论在白纸上画出以下4种细胞，用文字、箭头、细胞图构建）。
活动二：【小组讨论】
1.为什么给小鼠注射TNF？
2.会有几种细胞融合方式（只考虑未融合和两个细胞融合的2种情况）？
3.杂交瘤细胞是如何筛选出来的？
4.有几次筛选过程？目的是什么？
5.如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？
活动二：【小组讨论】
结合图2-16: 米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程的示意图，尝试用构建制备抗TNF单克隆抗体的流程（每个小组自己讨论在白纸上画以下4种细胞，并用其构建流程），并思考以下问题：
B1：抗白细胞介素4
B2：抗TNF
B3：抗白细胞介素10
从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞，培养
多种已免疫B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
小鼠的脾脏中获取
注射特定的抗原,从小鼠脾中获得能产生特定抗体的淋巴B细胞
（三）单克隆抗体的制备过程（非常重要）
方法：电融合法、PEG融合法、灭活病毒诱导法等
02
2
杂交瘤细胞(多种)
1
3
置于选择培养基上培养
第一次筛选
诱导融合后的细胞
BB
B
B1-瘤
瘤瘤
瘤
B2-瘤
B3-瘤
第一次筛选：用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（三）单克隆抗体的制备过程（非常重要）
资料2：已知细胞合成DNA有D(全合成途径)和S（补救合成途径）两条途径，其中D途径能被氨基喋呤（A）阻断。B淋巴细胞中这两种DNA的合成途径都有，但B淋巴细胞不能无限增殖。而鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径， 但它能不断分裂增殖。
活动三：请根据以上信息，设计一种方法，从培养液中筛选出杂交瘤细胞。
注：次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）
【第一次筛选】获得杂交瘤细胞
筛选出杂交瘤细胞方法？
培养基中加入氨基喋呤（HAT选择培养基）
B淋巴细胞及同型融合细胞(B、B-B)
能合成DNA，但不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
(瘤、瘤-瘤)
不能合成DNA导致不能增殖，死亡
杂交瘤细胞
（B1-瘤、B2-瘤、B3-瘤）
既能利用HGPRT合成DNA，又可无限增殖，生长
知识拓展
第二次筛选产生抗TNF抗体的杂交瘤细胞
Q：分泌的抗体都是抗TNF的吗？如何检测？
杂交瘤细胞
方法：克隆化培养和专一抗体（TNF）检测(分子水平）
骨髓瘤细胞
B2淋巴细胞
筛选出
再进行体外或体内培养
Q:如何获得大量的单克隆抗体？
多孔细胞培养板
阳性孔
在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养 （克隆化培养）
一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔
抗体检测板
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
【第二次筛选】能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
知识拓展
抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法
单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选 原因
目的
筛选 方法
筛选出杂交瘤细胞
筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞
体外培养
单克隆抗体
体内或体外培养
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔
【培养杂交瘤细胞的方法比较】
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
单克隆抗体的制备过程（模型建构）
给小鼠注射TNF
已免疫的B淋巴细胞
骨髓瘤细胞的培养
未融合细胞和多种杂交细胞
杂交瘤细胞
大量的抗TNF单克隆抗体
获得能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
诱导融合
HAT选择培养基
克隆化培养，专一抗体检测
体外培养或小鼠腹腔内增殖
既能大量繁殖又能产生专一抗体
单克隆抗体的应用
思考.讨论
阅读教材“思考 讨论单克隆抗体的应用” 中的资料，思考、讨论前3题。
1. ADC的抗体和药物各具有什么作用？
2. 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
3. 单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
讨论1：ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
3. 单克隆抗体的应用
讨论2： 除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
① 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
② 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
讨论3：单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
① 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
② ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
1、诊断试剂——最广泛应用抗原-抗体杂交法抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体在妊娠第8天就可以作出诊断，比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。具有准确、高效、简易、快速特点诊断优点：（四）单克隆抗体的应用艾滋病检测试剂血型检测试剂新冠病毒检测试剂
主要用于癌症治疗。
2、运载药物
优点：位置准确、疗效高、副作用小
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC（抗体-药物偶联物）
单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
单克隆抗体+同位素（荧光标记）2、运载药物在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。3、治疗疾病医药领域，单抗类药物占用重要地位概述
应用
动物细胞融合
技术
过程
结果
意义
原理
融合方法
原理
应用
单克隆抗体的制备
免疫处理
第一次筛选
诱导融合
第二次筛选
大规模培养
诊断试剂、运载药物、治疗疾病
克隆化培养
抗体检测
体外培养
小鼠腹腔
课堂小结
单克隆抗体的制备小结
（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________
（7）第二次筛选的目的________________________________________________
如何筛选_______________________________________ ____________
选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_____________ _____________
（8）抗体检测原理_______________________________________
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
既能迅速大量增殖，又能产生抗体
（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________
（10）如何获取单克隆抗体
①体外培养___________________________
②小鼠腹腔内培养_________________________
（11）单克隆抗体的优点_____________________________
_________________________________________________
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，
与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
阳
课后习题·概念检测
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
C
课后习题·概念检测
2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
这一实验结果说明了 ？
为研究RA的发生与细胞因子的关系，研究人员分别测定了多例健康志愿者和小明血清中细胞因子的平均含量，结果如下图。
注：肿瘤坏死因子（TNF）：由活化的巨噬细胞、T淋巴细胞等产生的细胞分子（小分子多肽）
白细胞介素--4/10（IL-4/IL-10）：由肥大细胞、嗜碱性粒细胞产生的细胞因子
对照组
症状期
缓解期
从社会中来
细胞因子TNF表达水平越高，患病程度越严重
有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？
马的动物细胞A
天鹅的动物细胞B
飞马？
需要什么技术？
思考：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
肺结核病人病理切片

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